Навіны

Традыцыйныя дыягнастычныя стратэгіі для выяўлення інфекцыйных захворванняў патрабуюць выкарыстання настольных прыбораў, якія не падыходзяць для тэсціравання на месцы (POCT).Новая мікрафлюідыка - гэта вельмі мініяцюрызаваная, аўтаматызаваная і інтэграваная тэхналогія, якая з'яўляецца патэнцыйнай альтэрнатывай традыцыйным метадам хуткай, недарагой і дакладнай дыягностыкі на месцы.Малекулярныя метады дыягностыкі шырока выкарыстоўваюцца ў мікрафлюідных прыладах як найбольш эфектыўныя метады выяўлення ўзбуджальнікаў.У гэтым аглядзе абагульняюцца апошнія дасягненні ў мікрафлюіднай малекулярнай дыягностыцы інфекцыйных захворванняў як з акадэмічнай, так і з прамысловай пункту гледжання.Спачатку мы апісваем тыповую апрацоўку нуклеінавых кіслот на чыпе, уключаючы папярэднюю апрацоўку ўзору, узмацненне і счытванне сігналу.Затым параўноўваюцца характарыстыкі, перавагі і недахопы чатырох тыпаў мікрафлюідных платформаў.Далей мы абмяркуем выкарыстанне лічбавых аналізаў для абсалютнага колькаснага вызначэння нуклеінавых кіслот.І класічныя, і нядаўнія камерцыйныя малекулярныя дыягнастычныя прыборы на мікрафлюіднай аснове абагульнены ў якасці доказу бягучага стану рынку.Нарэшце, мы прапануем будучыя напрамкі мікрафлюіднай дыягностыкі інфекцыйных захворванняў.
Інфекцыйныя захворванні выклікаюцца ўзбуджальнікамі, у тым ліку бактэрыямі, вірусамі і паразітамі, якія распаўсюджаны па ўсім свеце.У адрозненне ад іншых хвароб, узбуджальнікі хутка заражаюцца і распаўсюджваюцца паміж чалавекам і жывёламі праз прышчэпку, паветра і ваду [1].Прафілактыка інфекцыйных захворванняў вельмі важная як мера аховы здароўя.Тры асноўныя стратэгіі барацьбы з інфекцыйнымі захворваннямі: (1) кантроль крыніцы інфекцыі;(2) перапыненне шляху перадачы;(3) абарона адчувальных груп насельніцтва.Сярод асноўных стратэгій барацьба з крыніцай інфекцыі лічыцца найбольш важнай стратэгіяй з-за яе зручнасці і нізкай кошту.Хуткая дыягностыка, ізаляцыя і лячэнне інфіцыраваных людзей маюць вырашальнае значэнне, патрабуючы хуткіх, адчувальных і дакладных дыягнастычных стратэгій [2].Сучасная дыягностыка інфекцыйных захворванняў звычайна спалучае клінічнае абследаванне, заснаванае на прыкметах і сімптомах, і лабараторныя даследаванні, такія як культура клетак і малекулярная дыягностыка, якія патрабуюць падрыхтаванага персаналу, працаёмкіх працэдур і дарагога тэставальнага абсталявання [3, 4].Прадухіленне выбліскаў інфекцыйных захворванняў патрабуе хуткай, недарагой і дакладнай мясцовай дыягностыкі, асабліва ў раёнах з абмежаванымі рэсурсамі, дзе інфекцыйныя захворванні распаўсюджаныя і цяжкія [5], а таксама лячэння ў пустыні або на полі бою, дзе надзвычайныя сітуацыі непрадказальныя..медыцынскае абслугоўванне абмежавана [6].У гэтым кантэксце мікрафлюідыка - гэта тэхналогія, якая аб'ядноўвае тэхналогіі мікраэлектрамеханічных сістэм, нанатэхналогіі або матэрыялазнаўства для дакладных маніпуляцый вадкасцямі [7,8,9,10], забяспечваючы новыя магчымасці для выяўлення ў кропцы сыходу (POCT).) інфекцыйныя агенты па-за бальніц і лабараторый.У параўнанні з традыцыйнай працаёмкай дыягностыкай, мікрафлюідная тэхналогія дазваляе зэканоміць узоры і выдаткі на малекулярную дыягностыку падчас выбліскаў захворвання.Глабальнае распаўсюджванне каранавіруснай хваробы 2019 (COVID-19) выклікана цяжкім вострым рэспіраторным сіндромам каранавірусам 2 (SARS-CoV-2), таму яшчэ раз падкрэсліваецца важнасць мікрафлюідыкі для своечасовай прафілактыкі і барацьбы з пандэміяй [11, 12]. , 13].У адрозненне ад традыцыйнай дыягностыкі, мікрафлюідная POCT выкарыстоўвае невялікія партатыўныя прылады, пачынаючы ад настольных аналізатараў і заканчваючы невялікімі тэст-палоскамі для бакавога патоку, для праверкі побач з кропкай адбору [14].Гэтыя тэсты адрозніваюцца спрошчанай падрыхтоўкай пробы або без яе, хуткім узмацненнем сігналу і адчувальнымі паказаннямі сігналу, што прыводзіць да кароткай працягласці і дакладных вынікаў на працягу некалькіх хвілін.Даступнасць і масавая вытворчасць медыцынскіх інструментаў на аснове мікрафлюіды пашырыла іх эканамічна эфектыўныя і прамыя дыягнастычныя прымяненні па-за межамі бальніцы, побач з пацыентам і нават дома.
Сярод існуючых стратэгій дыягностыкі інфекцыйных захворванняў малекулярная дыягностыка з'яўляецца адной з найбольш адчувальных [15, 16].Акрамя таго, малекулярная дыягностыка часта выкарыстоўваецца ў якасці залатога стандарту для бесперапыннага выяўлення COVID-19, што дазваляе непасрэдна выяўляць спецыфічныя для віруса ўчасткі РНК або ДНК да пачатку імуннага адказу [17, 18].У бягучым аглядзе мы прадстаўляем апошнія дасягненні ў працэсах малекулярнай дыягностыкі інфекцыйных захворванняў на аснове мікрафлюіды, ад акадэмічнай пункту гледжання да будучых прамысловых перспектыў (мал. 1).Мы пачнем з трох ключавых этапаў выяўлення нуклеінавых кіслот: папярэдняя апрацоўка ўзору на чыпе, ампліфікацыя нуклеінавых кіслот і счытванне сігналу.Затым мы параўналі розныя тыпы мікрафлюідных платформаў з іх структурай і функцыямі, паказаўшы унікальныя характарыстыкі (моцныя і слабыя бакі).Лічбавае выяўленне нуклеінавых кіслот далей абмяркоўваецца і прыводзіцца ў якасці прыкладу тэхналогіі трэцяга пакалення для абсалютнага колькаснага вызначэння малекул інфекцыйных узбуджальнікаў.Акрамя таго, некалькі тыповых і найноўшых камерцыйных прылад POCT будуць прадстаўлены, каб прадэманстраваць бягучы стан рынку мікрафлюідных POCT для малекулярнай дыягностыкі.Мы таксама абмяркуем і растлумачым наша бачанне будучых прыкладанняў.
Модулі мікрафлюідных чыпаў для выяўлення нуклеінавых кіслот можна падзяліць на тры катэгорыі (адбор пробаў, распазнаванне і сігналізацыя) у адпаведнасці з іх функцыямі [19].Сярод гэтых модуляў модуль выбаркі ў асноўным рэалізуе лізіс узораў і экстракцыю нуклеінавых кіслот.Сэнсарны модуль у асноўным кантралюе пераўтварэнне і ўзмацненне сігналаў нуклеінавых кіслот.Модуль сігналізацыі выяўляе сігнал, пераўтвораны і апрацаваны датчыкам.Грунтуючыся на працэсе выяўлення нуклеінавых кіслот на чыпе, мы абагульнім розныя чыпы, якія могуць рэалізаваць функцыю «ўводу і вываду».
Першым крокам у выяўленні нуклеінавых кіслот з'яўляецца экстракцыя нуклеінавых кіслот, г.зн. вылучэнне мэтавай нуклеінавай кіслаты з зыходнага ўзору.Экстракцыя нуклеінавых кіслот праводзіцца для ачышчэння нуклеінавых кіслот ад іншых малекулярных забруджванняў, забеспячэння цэласнасці першаснай структуры малекул нуклеінавых кіслот і аптымізацыі вынікаў.Экстракцыя нуклеінавых кіслот патрабуе неабходнага лізісу ўзору і захопу нуклеінавых кіслот, якасць і эфектыўнасць якіх аказваюць велізарны ўплыў на вынікі даследаванняў і дыягностыкі.Любыя нязначныя пабочныя эфекты падчас экстракцыі могуць абмежаваць далейшае выяўленне.Напрыклад, метады палімеразнай ланцуговай рэакцыі (ПЦР) і петлёвай ізатэрмічнай ампліфікацыі (LAMP) інгібіруюцца некаторымі рэшткавымі арганічнымі растваральнікамі, такімі як этанол і ізапрапанол у рэагентах для выдзялення нуклеінавых кіслот [20].Вадкастная вадкасная экстракцыя і цвёрдафазная экстракцыя з'яўляюцца найбольш папулярнымі метадамі вылучэння нуклеінавых кіслот [21] , аднак вадкасная экстракцыя на чыпе вельмі абмежаваная, паколькі рэагенты, якія выкарыстоўваюцца ў вадкаснай экстракцыі, выклікаюць карозію большасці мікрафлюідных чыпаў .Тут мы вылучаем метады цвёрдафазнай экстракцыі на аснове мікрачыпаў і параўноўваем іх перавагі і недахопы.
Крэмній з'яўляецца матэрыялам падкладкі, сумяшчальным з нуклеінавымі кіслотамі дзякуючы сваёй біясумяшчальнасці, стабільнасці і лёгкасці мадыфікацыі [22].Важна адзначыць, што пры мадыфікацыі дыяксідам крэмнія або іншымі матэрыяламі гэты кампазіт дэманструе ўласцівасці адсарбаваць адмоўна зараджаныя нуклеінавыя кіслоты ва ўмовах нізкага рН і высокага ўзроўню солі пры элюіраванні растворамі з высокім рН і нізкім утрыманнем солі.На аснове гэтай з'явы можна ачысціць нуклеінавую кіслату.
Розныя формы матэрыялаў на аснове дыяксіду крэмнія выкарыстоўваліся для экстракцыі нуклеінавых кіслот у мікрафлюідыцы, такія як шарыкі дыяксіду крэмнія, парашкі, фільтры з мікрафібры і мембраны дыяксіду крэмнія [23, 24, 25, 26].У залежнасці ад уласцівасцяў матэрыялу матэрыялы на аснове крэмнію могуць выкарыстоўвацца ў мікрасхемах па-рознаму.Напрыклад, гранулы дыяксіду крэмнія, парашкі і камерцыйныя нанафільтры можна проста змясціць у поры або мікраканалы мікрафлюідных чыпаў і дапамагчы атрымаць нуклеінавыя кіслоты з узораў [27, 28, 29].Павярхоўна-мадыфікаваныя мембраны з дыяксіду крэмнія таксама могуць быць выкарыстаны для хуткай ачысткі ДНК ад патагенных мікраарганізмаў пры нізкай цане.Напрыклад, Wang et al.[30] Шляхам аб'яднання рэакцый дэнатурацыі ампліфікацыі з абменам ланцугом, апасродкаваным везікуламі, з мембранамі з дыяксіду крэмнія, пакрытым алігацукрыдамі хітазану, была прадстаўлена універсальная партатыўная сістэма, якая паспяхова выяўляла 102-108 колониеобразующих адзінак.(КОЕ)/мл Vibrio parahaemolyticus., і прысутнасць віруса было лёгка бачна.Паўэл і інш.[31] Затым для выяўлення віруса гепатыту С (ВГС), віруса імунадэфіцыту чалавека (ВІЧ), віруса Зіка і віруса папіломы чалавека і аўтаматычнага размнажэння былі выкарыстаны мікрачыпы на аснове крэмнія, у якім быў распрацаваны звілісты мікрарэактар ​​аб'ёмам 1,3 мкл для захопу РНК-вірусаў.і выканаць узмацненне in situ.У дадатак да гэтых метадаў мікракалонкі з мадыфікаваным паверхняй дыяксіду крэмнія таксама гуляюць ключавую ролю ў экстракцыі нуклеінавых кіслот, паколькі геаметрыя і ўласцівасці мадыфікуючага матэрыялу значна павялічваюць эфектыўнасць экстракцыі.Чэнь і інш.[32] прапанавалі мікрафлюідную платформу для вылучэння РНК з нізкай канцэнтрацыяй на аснове крэмніевых мікракалонак з амінакалонкамі.Гэта мікрафлюідная прылада аб'ядноўвае масіў мікрапіляраў плошчай 0,25 см2 на крамянёвай падкладцы для дасягнення больш высокай эфектыўнасці экстракцыі за кошт высокага суадносін плошчы паверхні і аб'ёму.Перавага гэтай канструкцыі ў тым, што мікрафлюідная прылада можа дасягнуць эфектыўнасці экстракцыі нуклеінавых кіслот да 95%.Гэтыя стратэгіі на аснове крэмнія дэманструюць каштоўнасць хуткага выдзялення нуклеінавых кіслот па нізкай цане.У спалучэнні з мікрафлюіднымі чыпамі стратэгіі экстракцыі на аснове крэмнія могуць не толькі павысіць эфектыўнасць выяўлення нуклеінавых кіслот, але і палегчыць мініяцюрызацыю і інтэграцыю аналітычных прылад [20].
Метады магнітнага падзелу выкарыстоўваюць магнітныя часціцы для ізаляцыі нуклеінавых кіслот у прысутнасці знешняга магнітнага поля.Магнітныя часціцы, якія звычайна выкарыстоўваюцца, ўключаюць магнітныя часціцы Fe3O4 або γ-Fe2O3, пакрытыя дыяксідам крэмнія, амінакіслой і карбаксілам [33,34,35,36].Адметнай рысай магнітных часціц у параўнанні з крэмніевымі метадамі SPE з'яўляецца прастата маніпулявання і кантролю з дапамогай знешніх магнітаў.
Выкарыстоўваючы электрастатычнае ўзаемадзеянне паміж нуклеінавымі кіслотамі і дыяксідам крэмнія, ва ўмовах высокага ўтрымання солі і нізкага pH, нуклеінавыя кіслоты адсарбуюцца на паверхні магнітных часціц, пакрытых дыяксідам крэмнія, у той час як ва ўмовах нізкага ўтрымання солі і высокага pH, малекулы могуць быць вымытыя. зноў..Магнітныя шарыкі з пакрыццём з дыяксіду крэмнія дазваляюць здабываць ДНК з узораў вялікага аб'ёму (400 мкл), выкарыстоўваючы рух з магнітным кіраваннем [37].У якасці дэманстрацыі Радрыгес-Матэас і інш.[38] выкарыстоўвалі наладжвальныя магніты для кантролю перадачы магнітных шарыкаў у розныя камеры.На аснове магнітных часціц, пакрытых дыяксідам крэмнія, 470 копій/мл геномнай РНК SARS-CoV-2 можна атрымаць з узораў сцёкавых вод для выяўлення зваротнай транскрыпцыі LAMP (RT-LAMP), і адказ можна прачытаць на працягу 1 гадзіны.няўзброеным вокам (мал. 2а).
Прыборы на аснове магнітных і порыстых матэрыялаў.Канцэптуальная схема мікрафлюіднага прылады IFAST RT-LAMP для выяўлення РНК SARS-CoV-2 (адаптавана з [38]).b Цэнтрабежная мікрапрылада для dSPE нуклеінавай кіслаты букальнага мазка (адаптавана з [39]).c Убудаваны канцэнтратар узораў з аўтаномным харчаваннем з дапамогай карты FTA® (адаптавана з [50]).d фільтравальнай паперы Fusion 5, мадыфікаванай хітазанам (адаптавана з [51]).SARS-CoV-2, цяжкі востры рэспіраторны сіндром, каранавірус 2, ізатэрмічная ампліфікацыя, апасродкаваная пятлёй зваротнай транскрыпцыі RT-LAMP, тэхналагічныя партнёры FTA Finders, нуклеінавая кіслата NA
Станоўча зараджаныя магнітныя часціцы ідэальна падыходзяць для далучэння фасфатнай асновы нуклеінавай кіслаты.Пры пэўнай канцэнтрацыі солі адмоўна зараджаныя фасфатныя групы нуклеінавых кіслот могуць быць станоўча зараджаныя на паверхні часціц магнітнага кампазіта.Таму для экстракцыі нуклеінавых кіслот былі распрацаваны магнітныя наначасціц з шурпатай паверхняй і высокай шчыльнасцю амінагруп.Пасля магнітнага падзелу і блакавання магнітныя наначасціцы і ДНК-комплексы можна непасрэдна выкарыстоўваць у ПЦР, што пазбаўляе ад неабходнасці складаных і працаёмкіх аперацый ачысткі і элюцыі [35].Магнітныя наначасціцы, пакрытыя адмоўнымі карбаксільнымі групамі, таксама выкарыстоўваліся для падзелу нуклеінавых кіслот, адсарбаваных на паверхні ў растворах поліэтыленгліколю і хларыду натрыю высокай канцэнтрацыі [36].З дапамогай гэтых магнітных шарыкаў з мадыфікаванай паверхняй экстракцыя ДНК сумяшчальная з наступнай ампліфікацыяй.Дзіньян і інш.[39] апісалі аўтаматызаваную партатыўную цэнтрабежную мікрафлюідную платформу для папярэдняй апрацоўкі нуклеінавых кіслот, што дазваляе нетэхнічнаму персаналу выкарыстоўваць яе на месцы.Акрамя таго, сумяшчальнасць ізаляванай ДНК з LAMP, метадам, які добра падыходзіць для аналізу нуклеінавых кіслот на месцы, дадаткова дэманструе мінімальныя патрабаванні да абсталявання і прыдатнасць для каларыметрычных аналізаў (мал. 2b).
Метады магнітных шарыкаў прапануюць магчымасць аўтаматызаванай экстракцыі, некаторыя з якіх існуюць у камерцыйных аўтаматычных экстрактарах нуклеінавых кіслот [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, ЗША), QIAcube® HT;CapitalBio (Пекін, Кітай) і Biomek®;Бекман (Маямі, ЗША).), Фларыда, ЗША)].Перавагі спалучэння магнітных шарыкаў і мікрафлюідыкі могуць быць выкарыстаны для эфектыўнай аўтаматызаванай экстракцыі нуклеінавых кіслот, што патэнцыйна можа паспрыяць развіццю малекулярнай дыягностыкі;аднак спалучэнне магнітных шарыкаў з мікрафлюідыкай па-ранейшаму ў значнай ступені залежыць ад складаных сістэм кіравання для дакладнага маніпулявання магнітнымі шарыкамі, што тлумачыць папулярнасць камерцыйных прадуктаў, якія з'яўляюцца грувасткімі і дарагімі, што абмяжоўвае далейшае прымяненне магнітных шарыкаў у POCT.
Некалькі порыстых матэрыялаў, такіх як мадыфікаваныя нітрацэлюлозныя фільтры, карты Finders Technology Associates (FTA), фільтравальныя паперы на аснове поліэфірсульфону і матэрыялы з гліканавым пакрыццём таксама выкарыстоўваліся для выяўлення нуклеінавых кіслот [40, 41, 42, 43, 44].Порыстыя валакністыя матэрыялы, такія як валакністая папера, упершыню выкарыстоўваліся для ізаляцыі ДНК шляхам фізічнага пераблытвання доўгаланцуговых малекул ДНК валокнамі.Дробныя пары прыводзяць да моцнага фізічнага абмежавання малекул ДНК, што станоўча ўплывае на экстракцыю ДНК.З-за розных памераў пор валакністай паперы эфектыўнасць экстракцыі не можа задаволіць патрэбы ампліфікацыі ДНК [45, 46].Карта FTA - гэта камерцыйная фільтравальная папера, якая выкарыстоўваецца ў галіне судовай медыцыны і шырока выкарыстоўваецца ў іншых галінах малекулярнай дыягностыкі.Дзякуючы выкарыстанню цэлюлознай фільтравальнай паперы, прасякнутай рознымі хімічнымі рэчывамі для лізісу клеткавых мембран ва ўзоры, вызваленая ДНК абаронена ад дэградацыі на тэрмін да 2 гадоў.Зусім нядаўна была распрацавана прасякнутая цэлюлозная папера для малекулярнага выяўлення розных узбуджальнікаў, уключаючы SARS-CoV-2, лейшманіёз і малярыю [47,48,49].ВІЧ у ізаляванай плазме непасрэдна лізуецца, і вірусная нуклеінавая кіслата ўзбагачаецца ў праточнай мембране FTA®, убудаванай у канцэнтратар, што дазваляе эфектыўна вырабляць нуклеінавую кіслату [50] (мал. 2c).Асноўная праблема выяўлення нуклеінавых кіслот з выкарыстаннем карт FTA заключаецца ў тым, што такія хімічныя рэчывы, як гуанідзін і ізапрапанол, інгібіруюць наступныя рэакцыі ампліфікацыі.Каб вырашыць гэтую праблему, мы распрацавалі фільтравальную паперу Fusion 5, мадыфікаваную хітазанам, якая спалучае ў сабе перавагі як фізічнага перапляцення малекул ДНК і кудзелістай фільтравальнай паперы, так і электрастатычнай адсорбцыі ДНК на злучэннях, мадыфікаваных хітазанам, для дасягнення высокаэфектыўнай экстракцыі нуклеінавых кіслот ..валакна фільтра [51] (мал. 2г).Аналагічным чынам Чжу і інш.[52] прадэманстравалі мадыфікаваны хитозаном метад ПЦР, заснаваны на капілярнай мікрафлюіднай сістэме in situ для хуткага выдзялення і выяўлення РНК віруса Зіка.Нуклеінавыя кіслоты можна адсарбаваць/дэсарбаваць у змешаным асяроддзі лізата/ПЦР, адпаведна, на аснове ўласцівасці пераключальніка ўключэння/выключэння хітазану.уключэння і выключэння», рэагуючы на ​​pH.
Як згадвалася вышэй, гэтыя стратэгіі спалучаюць у сабе перавагі розных цвёрдафазных матэрыялаў і павышаюць эфектыўнасць экстракцыі нуклеінавых кіслот у мікрафлюідыцы.У практычным прымяненні выкарыстанне гэтых матэрыялаў у вялікіх колькасцях з'яўляецца неэканамічным, і належная апрацоўка паверхні або мадыфікацыя паверхні звычайных матэрыялаў з дапамогай гэтых матэрыялаў таксама можа захаваць іх функцыі.Такім чынам, лічыцца, што рэалізацыя гэтых стратэгій пасля пілотнага даследавання можа знізіць выдаткі.
Тэставанне нуклеінавых кіслот на мікрафлюідных платформах часта выкарыстоўвае невялікія аб'ёмы ўзораў (<100 мкл), таму патрабуецца ампліфікацыя мэтавых нуклеінавых кіслот спецыфічнымі зондамі для пераўтварэння ў сігнал, які зручны для далейшага выяўлення (аптычнага, электрычнага і магнітнага) [53, 54]. Тэставанне нуклеінавых кіслот на мікрафлюідных платформах часта выкарыстоўвае невялікія аб'ёмы ўзораў (<100 мкл), таму патрабуецца ампліфікацыя мэтавых нуклеінавых кіслот спецыфічнымі зондамі для пераўтварэння ў сігнал, які зручны для далейшага выяўлення (аптычнага, электрычнага і магнітнага) [53, 54]. Пры тэставанні нуклеінавых кіслот на микрожидкостных платформах часта выкарыстоўваюцца невялікія аб'ёмы узораў (<100 мкл), таму патрабуецца ампліфікацыя целевых нуклеінавых кіслот з дапамогай спецыяльных зондаў для пераўтварэння ў сігнал, зручны для наступнага выяўлення (аптычнага, электрычнага і магнітнага) [53, 54]. Пры тэставанні нуклеінавых кіслот на мікрафлюідных платформах часта выкарыстоўваюцца невялікія аб'ёмы ўзораў (<100 мкл), таму патрабуецца ампліфікацыя мэтавых нуклеінавых кіслот адмысловымі зондамі для пераўтварэння іх у сігнал, зручны для наступнага выяўлення (аптычнага, электрычнага і магнітнага) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （（<100 мкл） ， 因此 需要 使用 特定 扩增 目标 ， 以 转换 为 为 便于 下游 检测 （光学 、 电学 和 磁学） 的 信号 信号 信号 [53, 54, 54, 54, 54, 54, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Вызначэнне нуклеінавых кіслот на микрожидкостных платформах звычайна выкарыстоўвае невялікія аб'ёмы узораў (<100 мкл), што патрабуе ампліфікацыі целевых нуклеінавых кіслот з дапамогай спецыяльных зондаў для пераўтварэння ў сігналы для наступнага выяўлення (аптычнага, электрычнага і магнітнага) [53, 54]]. Для выяўлення нуклеінавых кіслот на мікрафлюідных платформах звычайна выкарыстоўваюцца невялікія аб'ёмы ўзораў (<100 мкл), што патрабуе ампліфікацыі мэтавых нуклеінавых кіслот адмысловымі зондамі для пераўтварэння іх у сігналы для наступнай дэтэкцыі (аптычныя, электрычныя і магнітныя) [53, 54]] .Ампліфікацыя нуклеінавых кіслот у мікрафлюідыцы можа таксама паскорыць рэакцыі, аптымізаваць межы выяўлення, знізіць патрабаванні да ўзораў і павысіць дакладнасць выяўлення [55, 56].У апошнія гады з рэалізацыяй хуткага і дакладнага выяўлення ў мікрафлюідыцы былі выкарыстаны розныя метады ампліфікацыі нуклеінавых кіслот, уключаючы ПЦР і некаторыя ізатэрмічныя рэакцыі ампліфікацыі.У гэтым раздзеле будуць абагульнены метады выяўлення нуклеінавых кіслот на аснове мікрафлюідных сістэм.
ПЦР - гэта мадэляванне працэсу рэплікацыі ДНК арганізма, тэорыя якога падрабязна апісана ў іншым месцы і не будзе абмяркоўвацца тут.ПЦР можа ўзмацніць вельмі невялікую колькасць мэтавай ДНК/РНК з экспанентнай хуткасцю, што робіць ПЦР магутным інструментам для хуткага выяўлення нуклеінавых кіслот.У апошнія дзесяцігоддзі было распрацавана мноства партатыўных микрожидкостных прылад, абсталяваных сістэмамі цеплавога цыклу ПЦР для задавальнення патрэб дыягностыкі на месцы [57, 58].ПЦР на чыпе можна падзяліць на чатыры тыпу (звычайная, ПЦР з бесперапынным патокам, з прасторавым пераключэннем і канвектыўная ПЦР) у залежнасці ад розных метадаў кантролю тэмпературы [59].Напрыклад, Джы і інш.[60] распрацавалі метад колькаснай ПЦР з прамой зваротнай транскрыпцыяй (RT-qPCR) на сваёй уласнай мікрафлюіднай платформе для мультыплекснага выяўлення SARS-CoV-2, вірусаў грыпу A і B ва ўзорах мазкоў з горла (мал. 3a).Парк і інш.[61] стварылі просты чып для аналізу патагенаў шляхам інтэграцыі тонкаплёнкавай ПЦР, электродаў і мікрафлюіднага модуля на аснове полідыметылсілаксану, які кіруецца пальцам.Аднак абедзве працы ўвасабляюць агульныя недахопы звычайнай ПЦР.ПЦР патрабуе термоциклирования, што абмяжоўвае далейшую мініяцюрызацыю прылады і скарачае час тэставання.
Распрацоўка мікрафлюіднай ПЦР з бесперапынным патокам і ПЦР з пераключэннем прасторы мае вырашальнае значэнне для вырашэння гэтай праблемы.Выкарыстоўваючы доўгі змеепадобны канал або кароткі прамой канал, ПЦР з бесперапынным патокам можа забяспечыць хуткую ампліфікацыю за кошт актыўнай цыркуляцыі рэагентаў у трох зонах папярэдняга нагрэву з дапамогай помпы, якая не ўваходзіць у чып.Гэтая аперацыя паспяхова дазваляе пазбегнуць пераходнай фазы паміж рознымі тэмпературамі рэакцыі і, такім чынам, значна скарачае час тэставання [62] (мал. 3b).У іншым даследаванні Юнга і соавт.[63] прапанавалі новы ротарны генетычны аналізатар ПЦР, які спалучае характарыстыкі фіксаванай і праточнай ПЦР для звышхуткай і мультыплекснай ПЦР са зваротнай транскрыпцыяй (мал. 3с).Для ампліфікацыі нуклеінавых кіслот мікрачып ПЦР будзе круціцца праз тры награвальныя блокі пры розных тэмпературах: 1. Блок дэнатурацыі 94°C, 2. Блок адпалу пры 58°C, 3. Блок пашырэння пры 72°C.
Прымяненне ПЦР у мікрафлюідыцы.Схематычнае адлюстраванне dirRT-qPCR на мікрафлюіднай платформе (адаптавана з [60]).b Схематычнае адлюстраванне мікрачыпа ПЦР з бесперапынным патокам на аснове змеепадобнага канала (адаптавана з [62]).c Схематычнае адлюстраванне ротарнага генетычнага аналізатара ПЦР, які складаецца з мікрачыпа, трох награвальных блокаў і крокавага рухавіка (адаптавана з [63]).d Схема тэрмаканвекцыйнай ПЦР з цэнтрыфугаваннем і ўстаноўкай (адаптавана з [64]).DirRT-qPCR, прамая колькасная палімеразная ланцуговая рэакцыя зваротнай транскрыпцыі
Выкарыстоўваючы капіляры і завесы або нават тонкія пласціны, канвекцыйная ПЦР можа хутка ўзмацніць нуклеінавыя кіслоты з дапамогай натуральнай свабоднай цеплавой канвекцыі без неабходнасці вонкавага помпы.Напрыклад, мікрафлюідная платформа цыклічнага алефінавага палімера была распрацавана на вырабленай верціцца награвальнай прыступцы, якая выкарыстоўвае тэрмічны цыкл з цэнтрыфугаваннем у мікраканале цыкла ПЦР [64] (мал. 3d).Рэакцыйны раствор кіруецца цеплавой канвекцыяй, якая бесперапынна абменьваецца высокай і нізкай тэмпературамі ў мікраканале з кальцавой структурай.Увесь працэс узмацнення можа быць завершаны за 10 хвілін з мяжой выяўлення 70,5 пг/канал.
Як і чакалася, хуткая ПЦР з'яўляецца магутным інструментам для цалкам інтэграваных сістэм малекулярнай дыягностыкі і мультыплекснага аналізу ўзору і адказу.Хуткая ПЦР значна скарачае час, неабходны для выяўлення SARS-CoV-2, што спрыяе эфектыўнаму кантролю над пандэміяй COVID-19.
ПЦР патрабуе складанага термоциклера, які не падыходзіць для POCT.Зусім нядаўна метады ізатэрмічнай ампліфікацыі былі прыменены да мікрафлюідыкі, уключаючы, але не абмяжоўваючыся, LAMP, рэкамбіназна-палімеразную ампліфікацыю (RPA) і ампліфікацыю на аснове паслядоўнасцей нуклеінавых кіслот [65,66,67,68].З дапамогай гэтых метадаў нуклеінавыя кіслоты ўзмацняюцца пры пастаяннай тэмпературы, што спрыяе стварэнню недарагіх высокаадчувальных партатыўных прылад POCT для малекулярнай дыягностыкі.
Высокапрадукцыйныя аналізы LAMP на аснове мікрафлюіды дазваляюць шматразова выяўляць інфекцыйныя захворванні [42, 69, 70, 71].У спалучэнні з цэнтрабежнай мікрафлюіднай сістэмай LAMP можа дадаткова палегчыць аўтаматызацыю выяўлення нуклеінавых кіслот [69, 72, 73, 74, 75].Спін-і-рэагуйце SlipChip быў распрацаваны для візуальнага выяўлення некалькіх паралельных бактэрый з дапамогай LAMP [76] (мал. 4a).Пры выкарыстанні ў аналізе аптымізаванага LAMP стаўленне сігнал-шум флуарэсцэнцыі было прыблізна ў 5 разоў, а мяжа выяўлення дасягала 7,2 копіі/мкл геномнай ДНК. Больш за тое, існаванне пяці распаўсюджаных стрававальных бактэрыяльных узбуджальнікаў, у тым ліку Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis і Vibrio parahaemolyticus, было візуалізавана на аснове гэтага метаду за <60 хвілін. Больш за тое, існаванне пяці распаўсюджаных стрававальных бактэрыяльных узбуджальнікаў, у тым ліку Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis і Vibrio parahaemolyticus, было візуалізавана на аснове гэтага метаду за <60 хвілін.Больш за тое, наяўнасць пяці распаўсюджаных бактэрыяльных узбуджальнікаў стрававальнага гасцінца, у тым ліку Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis і Vibrio parahaemolyticus, была візуалізавана з дапамогай гэтага метаду менш чым за 60 хвілін.此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPАкрамя таго, прысутнасць пяці распаўсюджаных бактэрыяльных страўнікава-кішачных патагенаў, у тым ліку Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius і Vibrio parahaemolyticus, была візуалізавана з дапамогай гэтага метаду менш чым за 60 хвілін.
Перавагі LAMP у мікрафлюідыцы ўключаюць, сярод іншага, хуткую рэакцыю і мініяцюрнае выяўленне.Аднак з-за тэмпературы рэакцыі (каля 70°C) падчас LAMP непазбежна ўтвараюцца аэразолі, што прыводзіць да высокай частаты ілжывых спрацоўванняў.Спецыфічнасць аналізу, дызайн грунтоўкі і кантроль тэмпературы таксама неабходна аптымізаваць для LAMP.Акрамя таго, канструкцыі чыпаў, якія рэалізуюць выяўленне некалькіх мэтаў на адным чыпе, маюць вялікую каштоўнасць і павінны быць распрацаваны.Акрамя таго, LAMP падыходзіць для шматмэтавага выяўлення, інтэграванага ў адзін чып, што вельмі важна, але ёсць яшчэ шмат месца для развіцця.
Высокі ўзровень ілжывых спрацоўванняў LAMP можа быць часткова зменшаны з дапамогай RPA, паколькі адносна нізкая тэмпература рэакцыі (~37 °C) прыводзіць да адносна невялікай колькасці праблем з выпарэннем [77].У сістэме RPA два супрацьлеглых праймера ініцыююць сінтэз ДНК шляхам звязвання з рэкамбіназай, і ампліфікацыя можа быць завершана на працягу 10 хвілін [78,79,80,81].Такім чынам, увесь працэс RPA нашмат хутчэй, чым PCR або LAMP.У апошнія гады было паказана, што мікрафлюідычная тэхналогія яшчэ больш паляпшае хуткасць і дакладнасць RPA [82,83,84].Напрыклад, Лю і соавт.[85] распрацавалі мікрафлюідны інтэграваны аналіз ампліфікацыі палімеразы рэкамбіназы бакавога патоку для хуткага і адчувальнага выяўлення SARS-CoV-2 шляхам інтэграцыі зваротнай транскрыпцыі RPA (RT-RPA) і універсальнай сістэмы выяўлення тэст-палосак бакавога патоку.у адзіную микрофлюидную сістэму.Малюнак 4b).Мяжа выяўлення складае 1 копію/мкл або 30 копій/узор, і выяўленне можа быць завершана прыкладна за 30 хвілін.Конг і інш.распрацавалі носную мікрафлюідную прыладу.[86] выкарыстоўвалі тэмпературу цела і сістэму флуарэсцэнтнага выяўлення на мабільным тэлефоне для хуткага і непасрэднага выяўлення ДНК ВІЧ-1 з дапамогай RPA (малюнак 4c).Аналіз RPA, які можна насіць, выяўляе 100 копій/мл паслядоўнасці-мішэні на працягу 24 хвілін, дэманструючы вялікі патэнцыял для хуткай дыягностыкі ВІЧ-1-інфіцыраваных немаўлят ва ўмовах абмежаваных рэсурсаў.
Ізатэрмічнае ўзмацненне ў тэсціраванні на месцы (POCT).Распрацоўка і вытворчасць спінавых і рэакцыйных SlipChip.Пасля плазменнай зваркі верхні і ніжні чыпы былі сабраны з наборам гаек для фарміравання канчатковага чыпа (адаптавана з [76]).b Схема сістэмы MI-IF-RPA для выяўлення COVID-19 (адаптавана з [85]).c Схема надзенага тэсту RPA для хуткага выяўлення ДНК ВІЧ-1 (адаптавана з [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, вірус імунадэфіцыту чалавека ВІЧ, ампліфікацыя палімеразы рэкамбіназы RPA, святлодыёдны святлодыёд, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase-Polymerase Узмацненне
RPA на аснове мікрафлюіды хутка развіваецца, аднак кошт вырабу чыпа і спажыванне рэакцыі занадта высокія і павінны быць зніжаны, каб павялічыць даступнасць гэтай тэхналогіі.Акрамя таго, высокая адчувальнасць RPA можа паўплываць на ўзмацненне неспецыфічных прадуктаў, асабліва пры наяўнасці заражэння.Гэтыя абмежаванні могуць паўплываць на прымяненне RPA ў мікрафлюідных сістэмах і заслугоўваюць далейшай аптымізацыі.Добра распрацаваныя праймеры і зонды для розных мішэняў таксама неабходныя для павышэння магчымасці выкарыстання мікрафлюідных стратэгій на аснове RPA ў POCT.
Cas13 і Cas12a валодаюць здольнасцю выпадковым чынам расшчапляць нуклеінавыя кіслоты і, такім чынам, могуць быць распрацаваны ў якасці інструментаў выяўлення і дыягностыкі.Cas13 і Cas12a актывуюцца пры звязванні з ДНК або РНК-мішэнню адпаведна.Пасля актывацыі бялок пачынае расшчапляць іншыя бліжэйшыя нуклеінавыя кіслоты, пасля чаго накіроўвалыя РНК, накіраваныя на спецыфічныя для ўзбуджальніка нуклеінавыя кіслоты, могуць расшчапляць патушаныя флуарэсцэнтныя зонды і вызваляць флуарэсцэнцыю.Грунтуючыся на гэтай тэорыі, Kellner et al.[87] распрацавалі метад на аснове Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], і Broughton et al.[88] распрацавалі іншы падыход, заснаваны на Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
У апошнія гады з'явіліся розныя метады вызначэння нуклеінавых кіслот на аснове CRISPR [89, 90].Звычайныя метады на аснове CRISPR часта займаюць шмат часу і працы з-за некалькіх працэдур, уключаючы экстракцыю нуклеінавых кіслот, ампліфікацыю і выяўленне CRISPR.Ўздзеянне вадкасці на паветра можа павялічыць верагоднасць прытворнададатных вынікаў.Улічваючы вышэйсказанае, сістэмы на аснове CRISPR маюць вострую патрэбу ў аптымізацыі.
Для прыкладанняў выяўлення CRISPR-Cas12a і CRISPR-Cas13a была распрацавана мікрафлюідная платформа з пнеўматычным кіраваннем, якая можа выконваць 24 аналізу паралельна [91].Сістэма абсталявана прыладай для выяўлення флуарэсцэнцыі, якая абыходзіць ампліфікацыю нуклеінавых кіслот і аўтаматычна выяўляе фемтамалярныя ўзоры ДНК і РНК.Чэнь і інш.[92] інтэграваная рэкамбіназная ампліфікацыя з дапамогай сістэмы CRISPR-Cas12a ў цэнтрабежнай мікрафлюідыцы (мал. 5а).Гэтая праца пераадольвае цяжкасці інтэграцыі гэтых двух працэсаў, таму што Cas12a можа пераварваць ДНК-паведамляльніка і інгібіраваць працэс ампліфікацыі.Акрамя таго, Chen et al.[92] дадаткова захоўвалі рэакцыйныя рэагенты ў цэнтрабежным мікрафлюідным кантролі для аўтаматычнага завяршэння ўсяго працэсу.У іншай працы Silva et al.[93] распрацавалі метад дыягностыкі без узмацнення CRISPR/Cas12a і смартфон для выяўлення SARS-CoV-2 (мал. 5b).Гэты аналіз, вядомы як сістэма без ампліфікацыі на аснове мабільнага тэлефона, уключае CRISPR/Cas-залежны фермент, які заснаваны на візуалізацыі смартфонам сігналаў бурбалкі, якія ствараюцца каталазай у мікрафлюідных каналах.Адчувальнае выяўленне менш за 50 копій/мкл нуклеінавай кіслаты без папярэдняй ампліфікацыі, увесь працэс ад увядзення пробы да счытвання сігналу займае ўсяго 71 хвіліну.
Метады выяўлення нуклеінавых кіслот на аснове CRISPR.Цэнтрабежны POCT для комплекснай малекулярнай дыягностыкі на аснове CRISPR (адаптавана з [92]).b Распрацоўка тэсту CASCADE для аналізу SARS-CoV-2 на аснове смартфона (адаптавана з [93]).Ампліфікацыя рэкамбіназы RAA, матыў пратаспейсера PAM, кластэрызаваныя кароткія паліндромныя паўторы CRISPR праз рэгулярныя прамежкі часу, сістэма CASCADE без ампліфікацыі сотавага тэлефона з CRISPR/CAS-залежнымі ферментамі, 1-этыл-3-[3-дыметыламінапрапіл]карбадзіімід гідрахларыд EDC
Як апошні крок у выяўленні нуклеінавых кіслот, выяўленне сігналу непасрэдна адлюстроўвае вынікі дыягностыкі і з'яўляецца найважнейшым фактарам у распрацоўцы эфектыўнага, адчувальнага і дакладнага POCT.Сігналы можна счытваць з дапамогай розных метадаў, такіх як флуоресцентные, электрахімічныя, каларыметрычныя і магнітныя стратэгіі.У гэтым раздзеле мы апісваем абгрунтаванне кожнага падыходу і параўнаем малекулярную дыягностыку інфекцыйных захворванняў у мікрафлюідыцы.
Стратэгіі, заснаваныя на флуарэсцэнцыі, шырока выкарыстоўваюцца для POCT-дыягностыкі інфекцыйных захворванняў з-за іх выдатных пераваг: выдатная адчувальнасць, нізкі кошт, прастата ў эксплуатацыі і аналіз на месцы [94, 95].У гэтых стратэгіях выкарыстоўваюцца пазначаныя флюарафоры, такія як флуарэсцэнтныя фарбавальнікі і нанаматэрыялы, для стварэння выяўлянага сігналу (узмацненне або гашэнне флуарэсцэнцыі).Гэта адкрыццё сведчыць аб тым, што стратэгіі, заснаваныя на флуарэсцэнцыі, можна падзяліць на прамую флуоресцентную маркіроўку, флуоресцентную дэтэкцыю па ўключэнні і выключэнні сігналу [96].Прамое выяўленне флуарэсцэнтнай меткі выкарыстоўвае спецыяльныя флуарэсцэнтныя меткі для маркіроўкі пэўных лігандаў, якія ствараюць пэўную колькасць флуарэсцэнцыі пры выбарачным звязванні з мішэнню.Для выяўлення флуарэсцэнцыі на аснове сігналу якасць флуарэсцэнтнага сігналу станоўча залежыць ад велічыні, якая нас цікавіць.Інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі нязначная ў адсутнасць мішэні і выяўляецца, калі прысутнічае дастатковая колькасць мішэні.І наадварот, інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі, выяўленая флуарэсцэнцыяй «адключэння сігналу», зваротна прапарцыйная колькасці мішэні, першапачаткова дасягаючы максімальнага значэння і паступова памяншаючыся па меры павелічэння мішэні.Напрыклад, выкарыстоўваючы механізм транс-расшчаплення, які залежыць ад мэты CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] распрацавалі новую стратэгію распазнання для выяўлення РНК, якія непасрэдна абыходзяць зваротную транскрыпцыю (мал. 6а).Пасля звязвання з камплементарнымі мэтавымі РНК комплекс CRISPR-Cas13-РНК можа быць актываваны, запускаючы трансколлатеральное расшчапленне неспецыфічнымі рэпарцёрных РНК.Флуарэсцэнтна пазначаны рэпарцёр [флуарафор (F)] гасіцца тушыцелем (Q) у цэласці і флуарэсцэнцыі пры расшчапленні актываваным комплексам.
Перавагай электрахімічнага выяўлення з'яўляецца высокая хуткасць выяўлення, простая вытворчасць, нізкі кошт, зручнасць пераноскі і аўтаматычнае кіраванне.Гэта магутны аналітычны метад для прымянення POCT.На аснове графенавых палявых транзістараў Гао і інш.[98] распрацавалі нанабіясенсар для мультыплекснага выяўлення антыгенаў хваробы Лайма з бактэрый Borrelia burgdorferi з мяжой выяўлення 2 пг/мл (мал. 6b).
Каларыметрычныя аналізы выкарыстоўваліся ў праграмах POCT, карыстаючыся перавагамі мабільнасці, нізкай кошту, прастаты падрыхтоўкі і візуальнага чытання.Каларыметрычнае выяўленне можа выкарыстоўваць акісленне пероксидазы або пероксидазоподобных нанаматэрыялаў, агрэгацыю нанаматэрыялаў і даданне індыкатарных фарбавальнікаў для пераўтварэння інфармацыі аб наяўнасці мэтавых нуклеінавых кіслот у бачныя змены колеру [99, 100, 101].Характэрна, што наначасціцы золата шырока выкарыстоўваюцца ў распрацоўцы каларыметрычных стратэгій, і з-за іх здольнасці выклікаць хуткія і значныя змены колеру расце цікавасць да распрацоўкі каларыметрычных платформаў POCT для дыягностыкі інфекцыйных захворванняў in situ [102].З інтэграванай цэнтрабежнай мікрафлюіднай прыладай [103] харчовыя патагенныя мікраарганізмы ў пробах заражанага малака могуць быць аўтаматычна выяўлены на ўзроўні 10 бактэрыяльных клетак, а вынікі можна прачытаць візуальна на працягу 65 хвілін (мал. 6c).
Метады магнітнага зандзіравання могуць дакладна выяўляць аналіты з дапамогай магнітных матэрыялаў, і ў апошнія дзесяцігоддзі назіраецца значная цікавасць да прымянення POCT.Метады магнітнага зандзіравання маюць некаторыя унікальныя перавагі, такія як нізкі кошт магнітных матэрыялаў, а не дарагія аптычныя кампаненты.Аднак выкарыстанне магнітнага поля павышае эфектыўнасць выяўлення і скарачае час падрыхтоўкі пробы [104].Акрамя таго, вынікі магнітнага зандзіравання дэманструюць высокую спецыфічнасць, адчувальнасць і высокае стаўленне сігнал/шум з-за нязначнага магнітнага фонавага сігналу біялагічных узораў [105].Шарма і інш.убудаваны біядатчык на аснове магнітнага тунэльнага злучэння ў партатыўную платформу мікрачыпа.[106] для мультыплекснага выяўлення патагенаў (мал. 6d).Біясенсары адчувальна выяўляюць субнаномолярные нуклеінавыя кіслоты, выдзеленыя з узбуджальнікаў.
Тыповы метад выяўлення сігналу.Канцэпцыя гиперлокализованного выяўлення Cas13a (адаптавана з [97]).b Графенавы нанабіясенсар FET у спалучэнні з Lyme GroES scFv (адаптавана з [98]).c Каларыметрычныя паказанні для мультыплекснага выяўлення харчовых патагенаў у цэнтрабежным мікрафлюідным чыпе: узоры № 1 і № 3 з мэтавымі патагенамі і ўзоры № 2, № 4 і № 5 без мэтавых патагенаў (адаптавана з [103]) .d Біясенсар на аснове магнітнага тунэльнага злучэння, уключаючы платформу, убудаваны блакіруючы ўзмацняльнік, блок кіравання і крыніцу харчавання для генерацыі/атрымання сігналу (адаптавана з [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, ПММА поліметылметакрылат
Нягледзячы на ​​выдатныя характарыстыкі вышэйпералічаных метадаў выяўлення, яны ўсё ж маюць недахопы.Гэтыя метады параўноўваюцца (табліца 1), уключаючы некаторыя прыкладанні з дэталямі (плюсы і мінусы).
З развіццём мікрафлюідыкі, мікраэлектрамеханічных сістэм, нанатэхналогій і матэрыялазнаўства выкарыстанне мікрафлюідных чыпаў для выяўлення інфекцыйных захворванняў пастаянна прасоўваецца [55,96,107,108].Дакладныя маніпуляцыі з мініяцюрным абсталяваннем і вадкасцямі спрыяюць дыягнастычнай дакладнасці і эканамічнай эфектыўнасці.Такім чынам, для далейшага развіцця былі зроблены намаганні па аптымізацыі і мадэрнізацыі чыпаў, у выніку чаго з'явіліся розныя мікрафлюідныя чыпы з рознымі структурамі і функцыямі.Тут мы коратка прадставім некалькі распаўсюджаных тыпаў мікрафлюідных платформаў і параўнаем іх характарыстыкі (плюсы і мінусы).Акрамя таго, большасць прыкладаў, пералічаных ніжэй, у асноўным накіраваны на барацьбу з SARS-CoV-2.
LOCC з'яўляюцца найбольш распаўсюджанымі мініяцюрызаванымі складанымі аналітычнымі сістэмамі, і іх аперацыі вельмі мініяцюрызаваныя, інтэграваныя, аўтаматызаваныя і паралелізаваныя ад увядзення і падрыхтоўкі проб, кантролю патоку і выяўлення вадкасці [109, 110].Вадкасцямі маніпулююць з дапамогай старанна распрацаванай геаметрыі і ўзаемадзеяння многіх фізічных эфектаў, такіх як градыенты ціску, капілярнае дзеянне, электрадынаміка, магнітныя палі і акустычныя хвалі [111].LOCC паказвае выдатныя перавагі ў высокапрадукцыйным скрынінгу і шматразовым выяўленні, з высокай хуткасцю аналізу, невялікім памерам выбаркі, нізкім энергаспажываннем і высокай эфектыўнасцю кіравання і працы;аднак прылады LOCC вельмі далікатныя, а таксама вытворчасць, упакоўка і ўзаемадзеянне.Аднак мультыплексаванне і паўторнае выкарыстанне сутыкаюцца з велізарнымі цяжкасцямі [96].У параўнанні з іншымі платформамі LOCC мае унікальныя перавагі з пункту гледжання максімальнай разнастайнасці прыкладанняў і лепшай сумяшчальнасці тэхналогій, але яе недахопы таксама відавочныя, а менавіта высокая складанасць і дрэнная паўтаральнасць.Залежнасць ад знешніх помпаў, якія часта з'яўляюцца грувасткімі і дарагімі, яшчэ больш абмяжоўвае іх выкарыстанне ў POCT.
Падчас успышкі COVID-19 LOCC атрымаў вялікую ўвагу.У той жа час ёсць некалькі новых чыпаў, якія аб'ядноўваюць некалькі тэхналогій.Напрыклад, смартфоны цяпер шырока выкарыстоўваюцца ў якасці партатыўных аналітычных прылад і маюць вялікі патэнцыял для інтэграцыі LOCC.Сунь і інш.[21] вырабілі мікрафлюідны чып, які дазваляе мультыплексаваць пэўныя паслядоўнасці нуклеінавых кіслот пяці ўзбуджальнікаў, уключаючы SARS-CoV-2, з дапамогай LAMP і прааналізавалі іх з дапамогай смартфона на працягу 1 гадзіны пасля заканчэння рэакцыі.У якасці іншага прыкладу Sundah et al.[112] стварылі малекулярны перамыкач [каталітычнае ўзмацненне пераключальнікам малекулярнага пераходнага стану (CATCH)] для прамога і адчувальнага выяўлення мішэняў РНК SARS-CoV-2 з дапамогай смартфонаў. CATCH сумяшчальны з партатыўным LOCC і дасягае найвышэйшай прадукцыйнасці (прыкладна 8 копій РНК/мкл; <1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы) [112]. CATCH сумяшчальны з партатыўным LOCC і дасягае найвышэйшай прадукцыйнасці (прыкладна 8 копій РНК/мкл; <1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы) [112]. CATCH сумяшчальны з партатыўным LOCC і забяспечвае высокую прадукцыйнасць (прыкладна 8 копій РНК/мкл; < 1 ч пры пакаёвай тэмпературы) [112]. CATCH сумяшчальны з партатыўным LOCC і забяспечвае выдатную прапускную здольнасць (прыкладна 8 копій РНК/мкл; <1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/мкл；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/мкл；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH сумяшчальны з партатыўнымі LOCC і валодае выдатнай прадукцыйнасцю (прыкладна 8 копій РНК/мкл; < 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы) [112]. CATCH сумяшчальны з партатыўнымі LOCC і мае выдатную прадукцыйнасць (прыкладна 8 копій РНК/мкл; < 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы) [112].Акрамя таго, прылады LOCC для малекулярнай дыягностыкі таксама выкарыстоўваюць некаторыя рухаючыя сілы, такія як вакуум, расцяжэнне і электрычныя палі.Кан і інш.[113] прадэманстравалі звышхуткую ПЦР з нанаплазмай на чыпе ў рэжыме рэальнага часу для хуткай і колькаснай дыягностыкі COVID-19 у палявых умовах з выкарыстаннем вакуумнага плазмоннага вадкаснага ПЦР-чыпа.Лі і інш.[114] пазней распрацавалі мікрафлюідны чып, які дазваляе дыягнаставаць COVID-19.Платформа выкарыстоўвае сістэму ўзмацнення RT-LAMP, каб вызначыць, станоўчы ці адмоўны ўзор.Пасля Рамачандран і інш.[115] дасягнулі адпаведных градыентаў электрычнага поля, выкарыстоўваючы изотахофорез (ITP), селектыўны метад факусоўкі іёнаў, рэалізаваны ў мікрафлюідыцы.З ITP мэтавая РНК з неапрацаваных узораў мазка з насаглоткі можа быць аўтаматычна ачышчана.Затым Рамачандран і інш.[115] Спалучэнне гэтай ачысткі ITP з узмоцненымі ITP аналізамі LAMP і CRISPR выявіла SARS-CoV-2 у мазку з насаглоткі чалавека і клінічных узорах прыкладна за 35 хвілін.Акрамя таго, пастаянна з'яўляюцца новыя ідэі.Джадхав і інш.[116] прапанавалі дыягнастычную схему, заснаваную на спектраскапіі камбінацыйнага рассеяння з узмоцненай паверхняй у спалучэнні з мікрафлюідным прыладай, якая змяшчае альбо вертыкальна арыентаваныя вугляродныя нанатрубкі, пакрытыя золатам/срэбрам, альбо аднаразовыя мікра/нанатрубкі з электрапрадзеннем.Функцыяналізаваныя мембранай убудаваныя мікраканалы фільтра аднаразовыя.Прылада адсарбуе вірусы з розных цялесных вадкасцей/экссудацый, такіх як сліна, насаглотка і слёзы.Такім чынам, тытр віруса багаты, і вірус можна дакладна ідэнтыфікаваць па камбінацыйнаму рассеянню.
LOAD - гэта цэнтрабежная мікрафлюідная платформа, у якой усе працэсы кіруюцца частотным пратаколам, які круціць мікраструктураваны субстрат [110].Прылада LOAD характарызуецца выкарыстаннем цэнтрабежнай сілы ў якасці важнай рухаючай сілы.Вадкасці таксама схільныя капілярным сілам, сілам Эйлера і Карыёліса.Выкарыстоўваючы цэнтрыфугу, аналіз выконваецца ў рэжыме бесперапыннай працы вадкасці ад радыяльнага ўнутр да вонкавага становішча, ухіляючы неабходнасць дадатковых вонкавых трубак, помпаў, прывадаў і актыўных клапанаў.Карацей кажучы, адзіны метад кіравання спрашчае працу.Сілы, якія дзейнічаюць на вадкасць у адным і тым жа микрофлюидном канале на аднолькавай адлегласці ад цэнтра нагрузкі, роўныя, што дазваляе паўтарыць структуру канала.Такім чынам, абсталяванне LOAD больш простае і эканамічнае ў распрацоўцы і вытворчасці, чым звычайнае абсталяванне LOCC, у той час як рэакцыі ў значнай ступені незалежныя і паралелізаваныя;аднак, з-за высокай механічнай трываласці цэнтрабежнага абсталявання, даступны матэрыял чыпаў абмежаваны, і невялікія аб'ёмы складаныя.да машыны.У той жа час большасць прылад LOAD прызначаны толькі для аднаразовага выкарыстання, што дорага каштуе для буйнамаштабнага выяўлення [96, 117, 118, 119].
У апошнія дзесяцігоддзі LOAD, які лічыцца адным з найбольш перспектыўных мікрафлюідных прылад, атрымаў значную ўвагу з боку даследчыкаў і вытворцаў.Такім чынам, LOAD атрымаў шырокае прызнанне і выкарыстоўваецца для малекулярнай дыягностыкі інфекцыйных узбуджальнікаў [120, 121, 122, 123, 124], асабліва падчас успышкі COVID-19.Напрыклад, у канцы 2020 года Джы і інш.[60] прадэманстравалі прамы аналіз RT-qPCR для хуткага і аўтаматызаванага паралельнага выяўлення інфекцый SARS-CoV-2 і грыпу A і B ва ўзорах мазкоў з горла.Затым Xiong і інш.[74] прадставілі інтэграваную ў LAMP дыскаідную мікрафлюідную платформу для хуткага, дакладнага і адначасовага выяўлення сямі рэспіраторных каранавірусаў чалавека, уключаючы SARS-CoV-2, на працягу 40 хвілін.У пачатку 2021 года дэ Алівейра і інш.[73] прадэманстравалі цэнтрабежны мікрафлюідны чып з полістыролу з тонерам, які кіруецца ўручную з дапамогай ротатара пальца, для малекулярнай дыягностыкі COVID-19 RT-LAMP.Пасля Dignan і соавт.[39] прадставілі аўтаматызаваную партатыўную цэнтрыфугу для ачысткі РНК SARS-CoV-2 непасрэдна з зрэзаў буккального мазка.Мядзведзь і інш.[53] прапанавалі ўбудаваную сістэму адбору проб аэразоля SARS-CoV-2 з мікрафлюідным чыпам малога аб'ёму, які верціцца, з мяжой выяўлення 10 копій/мкл і мінімальным парогам цыкла 15 хвілін.Суарэс і інш.[75] нядаўна паведамілі аб распрацоўцы інтэграванай модульнай цэнтрабежнай мікрафлюіднай платформы для прамога вызначэння РНК SARS-CoV-2 у інактываваных цяплом узорах мазкоў з насаглоткі з выкарыстаннем LAMP.Гэтыя прыклады дэманструюць вялікія перавагі і перспектывы LOAD у малекулярнай дыягностыцы COVID-19.
У 1945 годзе Мюлер і Клег [125] упершыню прадставілі мікрафлюідныя каналы на паперы з выкарыстаннем фільтравальнай паперы і парафіна.У 2007 годзе група Whitesides [126] стварыла першую функцыянальную папяровую платформу для аналізу бялку і глюкозы.Папера стала ідэальнай падкладкай для мікрафлюідыкі.Папера валодае такімі ўласцівасцямі, як гідрафільнасць і сітаватая структура, выдатная біясумяшчальнасць, малы вага, гнуткасць, згортванне, нізкі кошт, прастата выкарыстання і зручнасць.Класічныя µPAD складаюцца з гідрафільных/гідрафобных структур, пабудаваных на папяровых падкладках.У залежнасці ад трохмернай структуры μPAD можна падзяліць на двухмерныя (2D) і трохмерныя (3D) μPAD.2D µPAD вырабляюцца шляхам фарміравання гідрафобных межаў для фарміравання мікрафлюідных каналаў, у той час як 3D µPAD звычайна вырабляюцца са стосаў слаёў 2D мікрафлюіднай паперы, часам з дапамогай складання паперы, метадаў слізгацення, адкрытых каналаў і 3D-друку [96].Водныя або біялагічныя вадкасці на μPAD у асноўным кантралююцца капілярнай сілай без знешняй крыніцы харчавання, што палягчае папярэдняе захоўванне рэагентаў, апрацоўку ўзораў і мультыплекснае выяўленне.Аднак дакладнаму кіраванню патокам і мультыплекснаму выяўленню перашкаджаюць недастатковая хуткасць выяўлення, адчувальнасць і шматразовае выкарыстанне [96, 127, 128, 129, 130].
Як незвычайная мікрафлюідная платформа, μPAD шырока прасоўваўся і распрацоўваўся для малекулярнай дыягностыкі інфекцыйных захворванняў, такіх як ВГС, ВІЧ і SARS-CoV-2 [131, 132].Для селектыўнага і адчувальнага выяўлення HCV Tengam et al.[133] распрацавалі новы біясенсар на аснове флуоресцентной паперы з выкарыстаннем высокаспецыфічнага зонда нуклеінавай кіслаты на аснове пирролидинилового пептыда.Нуклеінавыя кіслоты кавалентна імабілізуюцца на часткова акісленай цэлюлознай паперы шляхам аднаўленчага алкілавання паміж амінагрупамі і альдэгіднымі групамі, і выяўленне заснавана на флуарэсцэнцыі.Гэтыя сігналы можа быць прачытаны спецыяльна зробленым гаджэтам з партатыўнай люмінесцэнтнай камерай у спалучэнні з камерай мабільнага тэлефона.У далейшым Лу і соавт.[134] спраектавалі гнуткі электрод на папяровай аснове на аснове наначасціц нікеля/золата/вугляродных нанатрубак/металаарганічнага каркаса з полівінілавага спірту для выяўлення мішэні ВІЧ шляхам гібрыдызацыі ДНК з выкарыстаннем метыленавага сіняга ў якасці акісляльна-аднаўленчага індыкатара ДНК.Зусім нядаўна Chowdury et al.[135] прадставілі гіпатэтычны дызайн платформы для тэсціравання µPAD на месцы лячэння з выкарыстаннем сырой сліны пацыента ў спалучэнні з LAMP і партатыўнай тэхналогіяй візуалізацыі для выяўлення аналіту COVID-19.
Выпрабаванні бакавога патоку накіроўваюць вадкасці з дапамогай капілярных сіл і кантралююць рух вадкасці з дапамогай змочвальнасці і характарыстык порыстых або мікраструктураваных падкладак.Прылады бакавога патоку складаюцца з узору, кан'югата, інкубатара і выяўлення, а таксама ўбіраюць пракладкі.Малекулы нуклеінавых кіслот у LFA распазнаюць спецыфічныя злучныя рэчывы, якія папярэдне захоўваюцца ў месцы звязвання і звязваюцца ў выглядзе комплексаў.Калі вадкасць праходзіць праз інкубацыйныя і дэтэктыўныя пласціны, комплексы захопліваюцца малекуламі захопу, размешчанымі на тэставай і кантрольнай лініях, паказваючы вынікі, якія можна прачытаць няўзброеным вокам.Звычайна LFA можна завяршыць за 2-15 хвілін, што хутчэй, чым традыцыйнае адкрыццё.Дзякуючы спецыяльнаму механізму, LFA патрабуе некалькіх аперацый і не патрабуе дадатковага абсталявання, што робіць яго вельмі зручным.Ён просты ў вырабе і мініяцюрызацыі, а кошт папяровых падкладак ніжэй.Аднак ён выкарыстоўваецца толькі для якаснага аналізу, а колькаснае выяўленне вельмі складанае, а здольнасць мультыплексавання і прапускная здольнасць вельмі абмежаваныя, і адначасова можа быць выяўлена толькі адна дастатковая колькасць нуклеінавай кіслаты [96,110,127].
Хаця большасць прымянення LFA сканцэнтравана на імунааналізах, выкарыстанне LFA для малекулярнай дыягностыкі ў мікрафлюідных чыпах таксама з'яўляецца эфектыўным і папулярным [136].У выпадку віруснага гепатыту B, ВІЧ і SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] прапанавалі платформу LFA наначасціц з павышэннем канверсіі і прадэманстравалі ўніверсальнасць гэтай мініяцюрнай і партатыўнай платформы з дапамогай адчувальнага і колькаснага выяўлення некалькіх мішэняў, такіх як нуклеінавая кіслата HBV.Акрамя таго, Фу і соавт.[138] прадэманстравалі новы LFA, заснаваны на раманаўскай спектраскапіі з пашыраным паверхняй для колькаснага аналізу ДНК ВІЧ-1 пры нізкіх канцэнтрацыях.Для хуткага і адчувальнага выяўлення SARS-CoV-2 Лю і інш.[85] распрацавалі мікрафлюідна-інтэграваны аналіз бакавога патоку RPA, аб'яднаўшы RT-RPA і універсальную сістэму выяўлення бакавога патоку ў адну мікрафлюідную сістэму.
Прымяненне розных мікрафлюідных платформаў адрозніваецца ў залежнасці ад канкрэтных даследаванняў, у поўнай меры выкарыстоўваючы магчымасці і перавагі платформаў.Дзякуючы даступным па цане клапанам, помпам і паветраводам, LOCC - гэта самая поўная платформа для разнастайнасці прыкладанняў і ўзаемадзеяння з найбольшай магчымасцю для развіцця.Такім чынам, мы спадзяемся і рэкамендуем правесці найноўшыя даследаванні ў LOCC у якасці першай спробы і аптымізаваць умовы.Акрамя таго, чакаецца, што ў сістэме будуць знойдзены і выкарыстаны больш эфектыўныя і дакладныя метады.LOAD адрозніваецца дакладным кантролем вадкасці з існуючых прылад LOCC і дэманструе унікальныя перавагі ў адзіночных прывадах цэнтрабежнай сілы без неабходнасці знешніх прывадаў, у той час як паралельныя рэакцыі могуць быць асобнымі і сінхранізаванымі.Такім чынам, у будучыні LOAD стане асноўнай мікрафлюіднай платформай з меншай колькасцю ручных аперацый і больш сталымі і аўтаматызаванымі тэхналогіямі.Платформа µPAD спалучае ў сабе перавагі LOCC і матэрыялаў на папяровай аснове для недарагі аднаразовай дыягностыкі.Таму далейшае развіццё павінна быць арыентавана на зручныя і адпрацаваныя тэхналогіі.Акрамя таго, LFA добра падыходзіць для выяўлення няўзброеным вокам, што абяцае паменшыць спажыванне ўзораў і паскорыць выяўленне.Падрабязнае параўнанне платформы паказана ў табліцы 2.
Лічбавы аналіз падзяляе ўзор на мноства мікрарэактараў, кожны з якіх змяшчае асобную колькасць малекул-мішэняў [139, 140].Лічбавыя аналізы даюць значныя перавагі для выканання абсалютнага колькаснага вызначэння, выконваючы тысячы паралельных біяхімічных эксперыментаў адначасова і паасобку ў аддзяленнях мікроннага маштабу, а не ў бесперапыннай фазе.У параўнанні з традыцыйнай мікрафлюідыкай, кампартментныя рэакцыі могуць паменшыць аб'ём пробы, павялічыць эфектыўнасць рэакцыі і лёгка інтэгравацца з іншымі аналітычнымі метадамі без неабходнасці выкарыстання каналаў, помпаў, клапанаў і кампактных канструкцый [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Наступныя два метады выкарыстоўваюцца ў лічбавых аналізах для дасягнення раўнамернага і дакладнага падзелу раствораў, уключаючы рэагенты і ўзоры, такія як клеткі, нуклеінавыя кіслоты і іншыя часціцы або малекулы: (1) кропельныя эмульсіі, якія выкарыстоўваюць нестабільнасць паверхні паверхні вадкасці;(2) падзел масіва ажыццяўляецца геаметрычнымі абмежаваннямі прылады.У першым метадзе кроплі, якія змяшчаюць рэагенты і ўзоры ў мікраканалах, могуць быць створаны такімі пасіўнымі метадамі, як праматок, перакрыжаваны паток, факусоўка патоку, паэтапная эмульгацыя, эмульгацыя па мікраканалах і мембраны з дапамогай сіл вязкага зруху і эмульгирования са зменай канала.лакалізацыі [143, 145, 146, 148, 149] або з выкарыстаннем актыўных метадаў [150, 151], якія ўводзяць дадатковую энергію з дапамогай электрычнага, магнітнага, цеплавога і механічнага кантролю.У апошнім падыходзе найлепшая аднастайнасць аб'ёму вадкасці ў мікрафлюідных камерах падзяляецца шляхам захавання прасторавых структур аднолькавага памеру, такіх як мікраямы і паверхневыя масівы [152,153,154].Характэрна, што кроплі - гэта асноўныя ўчасткі патоку, якія таксама можна ствараць і маніпуляваць на масівах электродаў на аснове лічбавай мікрафлюідыкі (DMF).Электразмочванне дыэлектрыкаў з'яўляецца адной з найбольш вывучаных тэорый ДМФА, паколькі электразмочванне дыэлектрыкаў дазваляе дакладна маніпуляваць асобнымі кроплямі, кантралюючы форму вадкасці і асіметрычныя электрычныя сігналы, якія праходзяць праз розныя бакі [141, 144].Асноўныя аперацыі з кроплямі ў DMF ўключаюць сартаванне, расшчапленне і зліццё [151, 155, 156], якія могуць прымяняцца ў розных галінах аналізу, асабліва ў малекулярным выяўленні [157, 158, 159].
Лічбавае вызначэнне нуклеінавых кіслот - гэта тэхналогія малекулярнай дыягностыкі трэцяга пакалення пасля звычайнай ПЦР і колькаснай ПЦР у рэальным часе (кПЦР), паралельна з высокапрадукцыйным секвенированием і вадкаснай біяпсіяй.У апошнія два дзесяцігоддзі лічбавыя нуклеінавыя кіслоты атрымалі хуткае развіццё ў галіне малекулярнай дыягностыкі інфекцыйных узбуджальнікаў [160, 161, 162].Абсалютная колькасная ацэнка лічбавага выяўлення нуклеінавых кіслот пачынаецца з упакоўкі ўзораў і рэагентаў у асобныя адсекі, каб пераканацца, што кожная паслядоўнасць-мішэнь мае аднолькавую верагоднасць траплення ў кожны асобны адсек.Тэарэтычна кожнай секцыі можа быць прысвоена некалькі мэтавых паслядоўнасцей, альбо можа не быць незалежнай сістэмы мікрарэакцыі.З дапамогай розных механізмаў адчування, апісаных вышэй, аддзелы з мікробнымі паслядоўнасцямі-мішэнямі, якія генеруюць сігналы вышэй пэўнага парога, можна візуалізаваць няўзброеным вокам або з дапамогай машыны і пазначаць як станоўчыя, у той час як іншыя аддзелы, якія генеруюць сігналы ніжэй парога, пазначаюцца як станоўчыя .адмоўныя, якія робяць сігнал для кожнай секцыі лагічным.Такім чынам, падлічыўшы колькасць створаных аддзяленняў і ўзровень станоўчых вынікаў пасля рэакцыі, арыгінальныя копіі доследных узораў можна супаставіць з дапамогай формулы размеркавання Пуасона без неабходнасці стандартнай крывой, якая патрабуецца для звычайных колькасных аналізаў, такіх як як кПЦР.[163] У параўнанні з традыцыйнымі малекулярнымі метадамі дыягностыкі, лічбавае выяўленне нуклеінавых кіслот мае больш высокую ступень аўтаматызацыі, больш высокую хуткасць і адчувальнасць аналізу, меншую колькасць рэагентаў, меншае забруджванне і прасцейшы дызайн і выраб.Па гэтых прычынах выкарыстанне лічбавых аналізаў, асабліва кропельных метадаў, для малекулярнай дыягностыкі, якія спалучаюць метады ўзмацнення і счытвання сігналу, было добра вывучана падчас крытычнай успышкі SARS-CoV-2.Напрыклад, Інь і інш.[164] камбінавалі кропельныя лічбавыя і хуткія метады ПЦР для выяўлення генаў ORF1ab, N і РНКазы Р у SARS-CoV-2 у мікрафлюідным чыпе.Характэрна, што сістэма змагла ідэнтыфікаваць станоўчы сігнал на працягу 115 секунд, што хутчэй, чым звычайная ПЦР, што паказвае на яе эфектыўнасць у выяўленні на месцы (малюнак 7а).Донг і інш.[165], Соў і інш.[157], Чэнь і інш.[166] і Альтэры і інш.[167] таксама прымянілі кропельную лічбавую ПЦР (ddPCR) для выяўлення SARS-CoV-2 у мікрафлюіднай сістэме з уражлівымі вынікамі.Каб яшчэ больш палепшыць хуткасць выяўлення, Shen et al.[168] дасягнулі візуалізацыі чыпа на аснове ddPCR усяго за 15 секунд без выкарыстання метадаў злучэння малюнкаў, паскараючы працэс тэхналогіі ddPCR ад лабараторыі да прымянення.Прымяняюцца не толькі метады тэрмічнай ампліфікацыі, такія як ПЦР, але і метады ізатэрмічнай ампліфікацыі для спрашчэння ўмоў рэакцыі і хуткага адказу.Лу і інш.[71] распрацавалі SlipChip для кропельнага аналізу, здольны ствараць кроплі розных памераў пры высокай шчыльнасці за адзін крок і колькасна вызначаць нуклеінавыя кіслоты SARS-CoV-2 з дапамогай лічбавай LAMP (малюнак 7b).Як тэхналогія, якая хутка развіваецца, CRISPR таксама можа гуляць важную ролю ў лічбавым выяўленні нуклеінавых кіслот з дапамогай зручнай каларыметрычнай візуалізацыі без неабходнасці дадатковага афарбоўвання нуклеінавых кіслот.Акерман і інш.распрацаваў камбінаторную матрычную рэакцыю для мультыплекснай ацэнкі нуклеінавых кіслот.[158] выявілі 169 вірусаў, звязаных з чалавекам, у тым ліку SARS-CoV-2, у кроплях, якія змяшчаюць рэагенты для выяўлення нуклеінавых кіслот на аснове CRISPR-Cas13 у аналізе ў мікралунках (малюнак 7c).Акрамя таго, ізатэрмічнае ўзмацненне і тэхналогія CRISPR могуць выкарыстоўвацца ў адной сістэме, каб аб'яднаць перавагі абодвух.Парк і інш.[169] Лічбавы аналіз CRISPR/Cas12a быў распрацаваны ў камерцыйным мікрафлюідным чыпе для выяўлення экстрагаванага і знішчанага цяплом SARS-CoV-2 на аснове аднаступенчатага RT-RPA з больш кароткім і высокім выяўленнем сігнал-фон суадносіны часу., больш шырокі дынамічны дыяпазон і лепшая адчувальнасць (мал. 7d).Некаторыя апісанні гэтых прыкладаў прыведзены ў табліцы 3.
Тыповая лічбавая платформа для выяўлення нуклеінавых кіслот.a Рабочы працэс хуткай лічбавай ПЦР складаецца з чатырох ключавых этапаў: падрыхтоўка пробы, размеркаванне рэакцыйнай сумесі, працэс ампліфікацыі і колькаснае вызначэнне мішэні (адаптавана з [164]).b Схематычны аналіз кропель SlipChip для фарміравання кропель пры высокай шчыльнасці (адаптавана з [71]).c Схема працоўнага працэсу CARMEN-Cas13 (адаптавана з [158]).d Агляд удасканаленага лічбавага выяўлення вірусаў з CRISPR/Cas у адным гаршчку (адаптавана з [169]).Без вады ў алеі, полідыметылсілаксан PDMS, ПЦР-палімеразная ланцуговая рэакцыя, збор даных DAQ, прапарцыйная інтэгральная вытворная PID, камбінаторная матрычная рэакцыя CARMEN для ацэнкі мультыплекснай нуклеінавай кіслаты, SARS-CoV-2, цяжкі востры рэспіраторны сіндром, каранавірус 2, RT Ампліфікацыя зваротнай транскрыптазы рэкамбіназы палімеразы-RPA, сігнал S/B у фонавым рэжыме