Дзякуй за наведванне Nature.com.Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем візуалізаваць сайт без стыляў і JavaScript.
Метады ферментатыўнай блізкасці маркіроўкі, заснаваныя на актываваных эфірах або фенаксірадыкалах, шырока выкарыстоўваюцца для адлюстравання субклеткавых пратэёмаў і бялковых інтэрактараў у жывых клетках.Аднак актываваныя складаныя эфіры менш рэакцыйныя, што прыводзіць да шырокага радыусу маркіроўкі, а фенаксільныя радыкалы, якія ўтвараюцца пры апрацоўцы перакісам, могуць перашкаджаць акісляльна-аднаўленчым шляхам.Тут мы паведамляем пра метад фотаактывацыі, залежнай ад маркіроўкі блізкасці (PDPL), распрацаваны шляхам генетычнага звязвання бялку фотасенсібілізатара miniSOG з цікавым бялком.Узбуджаецца сінім святлом і кантралюецца часам уздзеяння, утвараецца сінглетны кісларод, а затым анілінавым зондам дасягаецца маркіроўка астаткаў гістыдыну з прасторава-часавым дазволам.Мы дэманструем яго высокую дакладнасць з дапамогай карціравання пратэомаў, спецыфічных для арганэл.Паралельнае параўнанне PDPL з TurboID паказвае больш канкрэтны і поўны пратэёмны ахоп PDPL.Затым мы ўжылі PDPL да асацыяванага з хваробай транскрыпцыйнага каактыватара BRD4 і E3 Parkin ligase і выявілі раней невядомыя ўзаемадзеянні.З дапамогай скрынінга празмернай экспрэсіі два невядомых субстрата, Ssu72 і SNW1, былі ідэнтыфікаваныя для Паркіна, дэградацыя якога апасродкавана шляхам убіквітынацыі-пратэасомы.
Дакладная характарыстыка бялковых сетак ляжыць у аснове многіх фундаментальных клеткавых працэсаў.Такім чынам, высокадакладнае прасторава-часовае адлюстраванне ўзаемадзеяння бялкоў забяспечыць малекулярную аснову для расшыфроўкі біялагічных шляхоў, паталогіі хваробы і парушэння гэтых узаемадзеянняў у тэрапеўтычных мэтах.З гэтай мэтай метады, здольныя выяўляць часовыя ўзаемадзеяння ў жывых клетках або тканінах, вельмі пажаданыя.Мас-спектраметрыя ачысткі па афіннасці (AP-MS) гістарычна выкарыстоўвалася для ідэнтыфікацыі партнёраў звязвання цікавых бялкоў (POI).З развіццём метадаў колькаснай пратэёмікі была створана Bioplex3.0 — найбуйнейшая база дадзеных бялковых сетак на аснове AP-MS.Нягледзячы на тое, што AP-MS з'яўляецца вельмі магутным, этапы лізісу і развядзення клетак у працоўным працэсе схілены да слабых і мінучых узаемадзеянняў звязвання і ўводзяць артэфакты пасля лізісу, такія як ілжывыя пары ўзаемадзеяння, у якіх адсутнічае кампартменталізацыя да лізісу.
Для вырашэння гэтых праблем былі распрацаваны ненатуральныя амінакіслоты (UAA) са сшываючымі групамі і платформы ферментатыўнай блізкай маркіроўкі (PL) (напрыклад, APEX і BioID)5.Нягледзячы на тое, што метад UAA быў паспяхова прыменены ў многіх сцэнарыях і дае інфармацыю аб пратэінавых клеях, аптымізацыя месца ўстаўкі UAA па-ранейшаму патрабуецца.Што яшчэ больш важна, гэта стэхіаметрычны метад маркіроўкі, у якім адсутнічае каталітычны разварот падзей маркіроўкі.Наадварот, ферментатыўныя метады PL, такія як метад BioID, зліваюць сканструяваную біятынавую лігазу з POI7, які пасля актывуе біятын з адукацыяй рэактыўнага прамежкавага эфіру біятынілавага АМФ.Такім чынам, фермент каталізуе і вызваляе актываванае біятынавае «воблака», якое пазначае праксімальныя рэшткі лізіну.Аднак BioID патрабуе больш за 12 гадзін для атрымання дастатковага пазначанага сігналу, што выключае яго выкарыстанне з часовым дазволам.Выкарыстоўваючы накіраваную эвалюцыю, заснаваную на адлюстраванні дрожджаў, TurboID быў распрацаваны на аснове BioID, каб быць больш эфектыўным, дазваляючы эфектыўна маркіраваць біятынам на працягу 10 хвілін, што дазваляе вывучаць больш дынамічныя працэсы.Паколькі TurboID вельмі актыўны, а ўзроўні эндагеннага біятыну дастатковыя для нізкаўзроўневай маркіроўкі, фонавая маркіроўка становіцца патэнцыйнай праблемай, калі патрабуецца ўзмоцненая і своечасовая маркіроўка шляхам дадання экзагеннага біятыну.Акрамя таго, актываваныя эфіры дрэнна рэакцыйныя (t1/2 ~5 мін), што можа прывесці да вялікага радыусу маркіроўкі, асабліва пасля насычэння суседніх бялкоў біятынам 5. У іншым падыходзе генетычнае зліццё сканструяванай аскорбатпероксидазы (напрыклад, біятын- фенольныя радыкалы і дазваляе пазначаць бялок на працягу адной хвіліны 9, 10. APEX шырока выкарыстоўваецца для ідэнтыфікацыі субклеткавых пратэёмаў, мембранных бялковых комплексаў і цытазольных сігнальных бялковых комплексаў 11, 12. Аднак неабходнасць высокіх канцэнтрацый пераксідаў можа паўплываць на акісляльна-аднаўленчыя вавёркі або шляхі, парушаючы клеткавых працэсаў.
Такім чынам, новы метад, здольны генераваць больш рэактыўныя віды падаўлення пазначанага радыусу з высокай прасторавай і часовай дакладнасцю без істотнага парушэння клеткавых шляхоў, будзе важным дадаткам да існуючых метадаў. Сярод рэактыўных відаў нашу ўвагу прыцягнуў сінглетны кісларод з-за яго кароткага часу жыцця і абмежаванага радыусу дыфузіі (t1/2 <0,6 мкс у клетках)13. Сярод рэактыўных відаў нашу ўвагу прыцягнуў сінглетны кісларод з-за яго кароткага часу жыцця і абмежаванага радыусу дыфузіі (t1/2 <0,6 мкс у клетках)13. Сярод актыўных форм наша ўвага прыцягвае сінглетны кісларод з-за яго кароткага часу жыцця і абмежаванага радыуса дыфузіі (t1/2 < 0,6 мкс у клетках)13. Сярод актыўных формаў нашу ўвагу прыцягнуў сінглетны кісларод з-за яго кароткага часу жыцця і абмежаванага радыусу дыфузіі (t1/2 <0,6 мкс у клетках)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 мкс）而引起了我们的注意13 1/2 < 0,6 мкс）而引起了我们的注意13 Сярод актыўных форм наша ўвага прыцягвае сінглетны кісларод з-за яго кароткага часу жыцця і абмежаванага радыуса дыфузіі (t1/2 < 0,6 мкс у клетках). Сярод актыўных формаў нашу ўвагу прыцягвае сінглетны кісларод з-за яго кароткага часу жыцця і абмежаванага радыусу дыфузіі (t1/2 <0,6 мкс у клетках).Паведамляецца, што сінглетны кісларод выпадкова акісляе метыёнін, тыразін, гістідін і трыптафан, што робіць яго палярным 14,15 для далучэння да зондаў на аснове амінаў або тыолаў16,17.Нягледзячы на тое, што сінглетны кісларод выкарыстоўваўся для пазначэння РНК субклеткавага аддзела, стратэгіі перапрафілявання эндагенных маркераў блізкасці POI застаюцца нявывучанымі.Тут мы прадстаўляем платформу пад назвай маркіроўка блізкасці, якая залежыць ад фотаактывацыі (PDPL), дзе мы выкарыстоўваем сіняе святло для асвятлення POI, злітых з фотасенсібілізатарам miniSOG, і запускаем выпрацоўку сінглетнага кіслароду для акіслення праксімальных рэшткаў, а затым мадыфікацыі, якія змяшчаюць амін, для акіслення хімічных зондаў у прамежкавыя жывыя клеткі..Мы пратэставалі групу хімічных зондаў, каб максымізаваць спецыфічнасць тэгаў, і вызначылі месцы мадыфікацыі з дапамогай адкрытага працоўнага працэсу пратэёмікі.Паралельнае параўнанне PDPL з TurboID паказвае больш канкрэтны і поўны пратэёмны ахоп PDPL.Мы ўжылі гэты падыход да арганэл-спецыфічных маркераў субклеткавага пратэома і агульнай ідэнтыфікацыі пратэома партнёраў па звязванні для асацыяванага з ракам эпігенетычнага рэгулятарнага бялку BRD4 і асацыяванай з хваробай Паркінсана Е3-лігазы Паркіна, што пацвердзіла як вядомую, так і невядомую сетку бялку ўзаемадзеяння..Здольнасць PDPL распазнаваць субстраты E3 у вялікіх бялковых комплексах уяўляе сабой сітуацыю, калі патрабуецца распазнаванне непрамых злучных рэчываў.Два невядомыя субстраты паркіна, апасродкаваныя ўбіквітынацыяй-пратэасомай, былі пацверджаны in situ.
Фотадынамічная тэрапія (PDT) 19 і лазерная інактывацыя з дапамогай храмафора (CALI) 20, пры якой светлавое апрамяненне з фотасенсібілізатарамі стварае сінглетны кісларод, можа інактываваць вавёркі-мішэні або выклікаць гібель клетак.Паколькі сінглетны кісларод з'яўляецца вельмі рэактыўным рэчывам з тэарэтычнай дыфузійнай адлегласцю каля 70 нм, можна кантраляваць прасторава абмежаванае акісленне вакол фотасенсібілізатара.Грунтуючыся на гэтай канцэпцыі, мы вырашылі выкарыстоўваць сінглетны кісларод для дасягнення дакладнай маркіроўкі бялковых комплексаў у жывых клетках.Мы распрацавалі хемопротеомический падыход PDPL для выканання чатырох функцый: (1) каталізаваць выпрацоўку актыўнага сінглетнага кіслароду, падобна ферментатыўнаму падыходу PL;(2) забяспечыць маркіроўку з дазволам па часе пры святле ініцыяцыі;(3) шляхам змены (4) Пазбягайце выкарыстання эндагенных кофакторов (такіх як біятын) для памяншэння фону або выкарыстоўвайце моцна ўзрушаючыя экзагенныя рэагенты (напрыклад, перакісы), каб мінімізаваць ўздзеянне клетак на навакольнае асяроддзе.
Фотасенсібілізатары можна падзяліць на дзве катэгорыі, уключаючы флюарафоры з нізкай малекулярнай масай (напрыклад, бенгальская ружа, метыленавы сіні)22 і генетычна закадзіраваныя невялікія вавёркі (напрыклад, miniSOG, KillerRed)23.Каб дасягнуць модульнай канструкцыі, мы распрацавалі платформу PDPL першага пакалення, дадаўшы бялкі фотасенсібілізатара (PS) у POI24,25 (малюнак 1а).Пры апрамяненні сінім святлом сінглетны кісларод акісляе праксімальныя рэшткі нуклеафільных амінакіслот, што прыводзіць да палярнасці умполунга, якая з'яўляецца электрафільнай і можа ў далейшым рэагаваць з нуклеафіламі аміназонда 16,17.Зонд распрацаваны з алкиновой ручкай, каб дазволіць хімію пстрычак і пацягнуць уніз для характарыстык ВХ/МС/МС.
Схематычная ілюстрацыя маркіроўкі бялковых комплексаў, апасродкаваных miniSOG.Пры ўздзеянні сіняга святла клеткі, якія экспрэсуюць miniSOG-POI, выпрацоўваюць сінглетны кісларод, які мадыфікуе ўзаемадзейнічаючыя вавёркі, але не вавёркі, якія не звязваюць.Прамежкавыя прадукты фотаакіслення перахопліваюцца рэлейнымі меткамі хімічнага зонда аміна з адукацыяй кавалентных аддуктаў.Алкінільная група на хімічным датчыку дазваляе ўзбагачаць хімічны склад з дапамогай выцягвання з наступным колькасным вызначэннем ВХ-МС/МС.b Хімічная будова амінных зондаў 1-4.c Рэпрэзентатыўны аналіз флуоресцентного геля мітахандрыяльнай лакалізаванай miniSOG-апасродкаванай пратэёмных маркераў з выкарыстаннем зондаў 1-4 і адноснай колькаснай ацэнкі на аснове гелевай денсітаметрыі.Суадносіны сігналу і фону хімічных зондаў ацэньвалі з дапамогай эксперыментаў з адмоўным кантролем, выключаючы сіняе святло, або з выкарыстаннем клетак HEK293T без экспрэсіі miniSOG.n = 2 біялагічна незалежных узору.Кожная кропка ўяўляе сабой біялагічную копію.d Рэпрэзентатыўнае выяўленне і колькасная ацэнка PDPL з выкарыстаннем аптымізаванага зонда 3 у прысутнасці або адсутнасці пазначаных кампанентаў PDPL, такіх як c.n = 3 біялагічна незалежных пробы.Кожная кропка ўяўляе сабой біялагічную копію.Цэнтральныя лініі і вусы ўяўляюць сярэдняе значэнне і ± стандартнае адхіленне.CBB: кумасі Brilliant Blue.e Канфакальнае малюнак сінглетнага кіслароду з афарбоўкай Si-DMA ў далёкі чырвоны колер.Шкала: 10 мкм.Гелевыя выявы і канфакальныя эксперыменты былі незалежна паўтараны як мінімум двойчы з аналагічнымі вынікамі.
Спачатку мы пратэставалі здольнасць спелых фотасенсібілізатараў miniSOG26 і KillerRed23, стабільна экспрэсіраваных у HEK293T, апасродкаваць прапаргіламінавую маркіроўку пратэёма ў якасці хімічнага зонда (дадатковая мал. 1а).Аналіз флуарэсцэнцыі геля паказаў, што маркіроўка ўсяго пратэома была дасягнута з выкарыстаннем miniSOG і апраменьвання сінім святлом, у той час як з KillerRed не назіралася бачнага прадукту маркіроўкі.Каб палепшыць суадносіны сігнал-фон, мы пратэставалі набор хімічных зондаў, якія змяшчаюць анілін (1 і 3), прапіламін (2) або бензіламін (4).Мы заўважылі, што самі клеткі HEK293T мелі больш высокі фонавы сігнал у параўнанні з адсутнасцю сіняга святла, магчыма, з-за эндагеннага фотасенсібілізатара рыбафлавіну, флавін-монануклеатыду (FMN) 27. Хімічныя зонды на аснове аніліну 1 і 3 далі лепшую спецыфічнасць, пры гэтым HEK293T стабільна экспрэсіўны miniSOG у мітахондрыях, дэманструючы больш чым 8-разовае павелічэнне сігналу для зонда 3, у той час як зонд 2, які выкарыстоўваўся ў метадзе маркіроўкі РНК CAP-seq, адлюстроўваў толькі ~2,5- кратнае павелічэнне сігналу, верагодна, з-за рознай рэакцыйнай здольнасці паміж РНК і бялком (мал. 1b, c). Хімічныя зонды на аснове аніліну 1 і 3 далі лепшую спецыфічнасць, пры гэтым HEK293T стабільна экспрэсіўны miniSOG у мітахондрыях, дэманструючы больш чым 8-разовае павелічэнне сігналу для зонда 3, у той час як зонд 2, які выкарыстоўваўся ў метадзе маркіроўкі РНК CAP-seq, адлюстроўваў толькі ~2,5- кратнае павелічэнне сігналу, верагодна, з-за рознай рэакцыйнай здольнасці паміж РНК і бялком (мал. 1b, c).Хімічныя зонды 1 і 3 на аснове аніліну прадэманстравалі лепшую спецыфічнасць: HEK293T, які стабільна экспрэсіруе miniSOG у мітахондрыях, паказвае больш чым 8-разовае павелічэнне сігналу для зонда 3, у той час як зонд 2, які выкарыстоўваецца ў метадзе маркіроўкі РНК CAP-seq, толькі паказвае ~ 2,5-разовае павелічэнне сігналу, верагодна, з-за розных пераваг рэактыўнасці паміж РНК і бялком (мал. 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好，(图1b，c）。).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAХімічныя зонды на аснове аніліну 1 і 3 мелі лепшую спецыфічнасць, HEK293T стабільна экспрэсіў miniSOG у мітахондрыях, а зонд 3 меў больш чым 8-разовае павелічэнне сігналу, у той час як зонд 2 для метаду маркіроўкі РНК CAP-seq паказаў толькі ~2,5-кратнае павелічэнне.у сігнале, верагодна, з-за розных пераваг рэакцыі паміж РНК і бялком (мал. 1b, c).Акрамя таго, былі пратэставаны ізамеры зонда 3 і гідразінавыя зонды (зонды 5, 6, 7), што пацвердзіла аптымізацыю зонда 3 (дадатковы малюнак 1b, c).Аналагічным чынам флуарэсцэнтны аналіз у гелі выявіў іншыя аптымізаваныя эксперыментальныя параметры: даўжыню хвалі апраменьвання (460 нм), канцэнтрацыю хімічнага зонда (1 мм) і час апраменьвання (20 хвілін) (дадатковы малюнак 2a–c).Адсутнасць любога кампанента або кроку ў пратаколе PDPL прывяло да значнага развароту сігналу да фону (мал. 1d).Характэрна, што маркіроўка бялку была значна зніжана ў прысутнасці азіду натрыю або тролокса, якія, як вядома, гасяць сінглетны кісларод.Наяўнасць D2O, які, як вядома, стабілізуе сінглетны кісларод, узмацняе сігнал маркіроўкі.Для вывучэння ўкладу іншых актыўных формаў кіслароду ў маркіроўку былі дададзены маніт і вітамін С, каб устанавіць паглынальнікі гідраксільных і супераксідных радыкалаў адпаведна 18, 29, але не было ўстаноўлена, што яны зніжаюць маркіроўку.Даданне H2O2, але не асвятленне, не прывяло да маркіроўкі (дадатковы мал. 3а).Флуарэсцэнтная візуалізацыя сінглетнага кіслароду з дапамогай зондаў Si-DMA пацвердзіла наяўнасць сінглетнага кіслароду ў дроце HEK293T-miniSOG, але не ў арыгінальным дроце HEK293T.Акрамя таго, mitoSOX Red не можа выявіць выпрацоўку супераксіду пасля асвятлення (мал. 1e і дадатковы малюнак 3b) 30. Гэтыя дадзеныя пераканаўча сведчаць аб тым, што сінглетны кісларод з'яўляецца асноўным актыўным формам кіслароду, адказным за наступную пратэёмную маркіроўку.Цытатаксічнасць PDPL была ацэненая, уключаючы апраменьванне сінім святлом і хімічныя зонды, і значнай цытатаксічнасці не назіралася (дадатковы малюнак 4а).
Каб вывучыць механізм маркіроўкі і ўключыць пратэёмную ідэнтыфікацыю бялковых комплексаў з дапамогай ВХ-МС/МС, нам спачатку трэба вызначыць, якія амінакіслоты мадыфікаваны, і дэльта-масу метак зондаў.Паведамляецца, што метионин, гістідіна, трыптафан і тыразін мадыфікуюцца синглетным кіслародам14,15.Мы інтэгруем працоўны працэс TOP-ABPP31 з аб'ектыўным адкрытым пошукам, які забяспечвае вылічальная платформа FragPipe на базе MSFragger32.Пасля мадыфікацыі сінглетнага кіслароду і маркіроўкі хімічным зондам хімія пстрычкі была праведзена з выкарыстаннем этыкеткі аднаўлення біятыну, якая змяшчае расшчапляемы лінкер, з наступным расцяжэннем нейтравідынам і расшчапленнем трыпсінаў.Мадыфікаваны пептыд, усё яшчэ звязаны са смалой, быў фотарасшчаплены для аналізу ВХ-МС/МС (малюнак 2а і дадатковыя дадзеныя 1).Вялікая колькасць мадыфікацый адбылася ва ўсім пратэёме з больш чым 50 супадзеннямі пептыднай карты (PSM) у спісе (мал. 2b).Дзіўна, але мы назіралі толькі мадыфікацыю гістідіна, верагодна, з-за больш высокай рэакцыйнай здольнасці акісленага гістідіна ў адносінах да анілінавых зондаў, чым іншых амінакіслот.Згодна з апублікаваным механізмам акіслення гістыдыну сінглетным кіслародам,21,33 прапанаваная структура дэльта-масы +229 Да адпавядае аддукту зонда 3 з 2-оксо-гістыдынам пасля двух акісленняў, у той час як +247 Да з'яўляецца прадуктам гідролізу. +229 Да (дадатковы малюнак 5).Ацэнка спектру MS2 паказала высокую надзейнасць ідэнтыфікацыі большасці іёнаў y і b, уключаючы ідэнтыфікацыю мадыфікаваных фрагментарных іёнаў (y і b) (мал. 2в).Кантэкстны аналіз лакальнай паслядоўнасці PDPL-мадыфікаваных гістыдзінаў выявіў умеранае перавага матыву для невялікіх гідрафобных рэшткаў у ±1 пазіцыі (дадатковы малюнак 4b).У сярэднім было вызначана 1,4 гістідіна на бялок, а месцы гэтых маркераў вызначаліся з дапамогай аналізу даступнай паверхні растваральніка (SASA) і адноснай даступнасці растваральніка (RSA) (дадатковы малюнак 4c,d).
Непрадузяты працоўны працэс для вывучэння рэшткавай селектыўнасці з выкарыстаннем вылічальнай платформы FragPipe на базе MSFragger.Расшчапляльныя лінкеры выкарыстоўваюцца ў хіміі Click, каб зрабіць магчымым фотаадшчапленне мадыфікаваных пептыдаў са смалы стрэптавідыну.Быў пачаты адкрыты пошук для выяўлення шматлікіх мадыфікацый, а таксама адпаведных рэшткаў.b Прызначце масу мадыфікацый, якія адбываюцца ва ўсім пратэёме.Карціраванне пептыдаў PSM.c MS2 спектральная анатацыя гістыдынавых сайтаў, мадыфікаваных зондам 3. У якасці рэпрэзентатыўнага прыкладу кавалентная рэакцыя з зондам 3 дадала +229,0938 Да да мадыфікаванай амінакіслоты.d Аналіз мутацый, які выкарыстоўваецца для вызначэння маркераў PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) і PRDX1 (H10A, H81A, H169A) былі трансфікаваны плазмідамі дзікага тыпу для выяўлення анты-Flag.e Сінтэтычны пептыд уступіў у рэакцыю з вычышчаным miniSOG у прысутнасці зонда 3 і адпаведныя прадукты з Δm +247 і +229 былі адзначаны ў спектры LC-MS.f Узаемадзеянне бялок-бялок in vitro, змадэляванае з дапамогай miniSOG-6xHis-тэгі і антыцелаў супраць 6xHis.Антыбіётын (стрэптавідын-HRP) і антымышыны Вестэрн-блот аналіз комплексаў антыцелаў miniSOG-6xHis/анты-6xHis, пазначаных зондам 3, у залежнасці ад часу ўздзеяння святла.Пазнакі для асобных бялкоў выражаюцца адпаведнай малекулярнай масай: лёгкі ланцуг антыцелаў LC, цяжкі ланцуг антыцелаў HC.Гэтыя эксперыменты былі незалежна паўтараны як мінімум два разы з аналагічнымі вынікамі.
Для біяхімічнай праверкі месца маркіроўкі PRDX3 і PRDX1, ідэнтыфікаваныя з дапамогай мас-спектраметрыі, былі заменены з гістідіна на аланін і параўнаваны з дзікім тыпам у аналізах трансфекцыі.Вынікі PDPL паказалі, што мутацыя значна зніжае маркіроўку (мал. 2d).Між тым, пептыдныя паслядоўнасці, ідэнтыфікаваныя ў адкрытым пошуку, былі сінтэзаваны і ўступілі ў рэакцыю in vitro з вычышчаным miniSOG у прысутнасці зонда 3 і сіняга святла, даючы прадукты са зрухам масы +247 і +229 Да пры выяўленні ВХ-МС (мал. 2e).).Каб праверыць, ці могуць ўзаемадзейнічаючыя праксімальныя вавёркі быць пазначаны in vitro ў адказ на фотаактывацыю miniSOG, мы распрацавалі аналіз штучнай блізкасці шляхам узаемадзеяння паміж бялком miniSOG-6xHis і моноклональными антыцеламі супраць His in vitro (малюнак 2f).У гэтым аналізе мы чакалі праксімальнай маркіроўкі цяжкіх і лёгкіх ланцугоў антыцелаў miniSOG.Фактычна, Вестэрн-блоты супраць мышы (распазнаючы цяжкія і лёгкія ланцугі антыцелаў, пазначаных анты-6xHis) і стрэптавідыну паказалі моцнае біятыніляванне цяжкіх і лёгкіх ланцугоў.Характэрна, што мы заўважылі аўтабіятыніляванне miniSOG з-за тэга 6xHis і крыжаваных сувязяў паміж лёгкімі і цяжкімі ланцугамі, што можа быць звязана з раней апісаным разрывам паміж праксімальным адказам на лізін і 2-оксо-гістыдын.У заключэнне мы робім выснову, што PDPL змяняе гістыдын у залежнасці ад блізкасці.
Нашай наступнай мэтай было ахарактарызаваць субклеточный протеом, каб праверыць спецыфічнасць маркіроўкі in situ.Такім чынам, мы стабільна выяўлена miniSOG ў ядры, мітахандрыяльнай матрыцы або вонкавай мембране ER клетак HEK293T (мал. 3а).Флуарэсцэнтны аналіз геля выявіў багатыя пазначаныя палосы ў трох субклеткавых месцах, а таксама розныя схемы маркіроўкі (мал. 3b).Аналіз флуарэсцэнтнай візуалізацыі паказаў высокую спецыфічнасць PDPL (мал. 3c).Працоўны працэс PDPL суправаджаўся рэакцыямі пстрычкі з радамінавымі фарбавальнікамі для акрэслення субклеткавых пратэомаў з дапамогай флуарэсцэнтнай мікраскапіі, а сігналы PDPL былі лакалізаваны з дапамогай DAPI, мітахандрыяльных трэкераў або трэкераў ER, што пацвярджае высокую дакладнасць PDPL.Паралельнае параўнанне PDPL з TurboID з выкарыстаннем авідыну Вестэрн-блот паказала, што PDPL пазначаны больш канкрэтна ў параўнанні з адпаведнымі кантрольнымі групамі трох месцаў арганэл.Ва ўмовах PDPL з'явілася больш пазначаных палос, што сведчыць аб большай колькасці бялкоў, пазначаных PDPL (дадатковы малюнак 6a-d).
Схематычнае адлюстраванне miniSOG-апасродкаванай арганэл-спецыфічнай маркіроўкі пратэёма.miniSOG нацэльваецца на мітахандрыяльны матрыкс шляхам зліцця з N-канцавымі 23 амінакіслотамі ЦОГ4 чалавека (mito-miniSOG), на ядро праз зліццё з H2B (nucleus-miniSOG) і Sec61β праз цытаплазматычны бок мембраны ER (ER-miniSOG ).Паказанні ўключаюць гелевую візуалізацыю, канфакальную візуалізацыю і мас-спектраметрыю.b Рэпрэзентатыўныя гелевыя выявы трох спецыфічных для арганэл профіляў PDPL.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Рэпрэзентатыўныя канфакальныя выявы клетак HEK293T, якія стабільна экспрэсуюць miniSOG, з рознымі субклеткавым лакалізацыямі, выяўленымі антыцеламі, пазначанымі V5 (чырвоным).Субклеткавых маркеры выкарыстоўваюцца для мітахондрый і ER (зялёны).Рабочы працэс PDPL уключае выяўленне субклеткавых пратэёмаў, пазначаных miniSOG (жоўты), з выкарыстаннем хіміі націску Cy3-азіду.Шкала: 10 мкм.d Вулканічныя графікі пратэёмаў, пазначаных PDPL, у розных арганэлах, колькасна ацэненых шляхам немаркіраванага колькаснага вызначэння (n = 3 незалежныя біялагічныя эксперыменты).Двухбаковы t-крытэр Ст'юдэнта выкарыстоўваўся на графіках вулканаў.HEK293T дзікага тыпу быў выкарыстаны ў якасці адмоўнага кантролю. Значна змененыя вавёркі вылучаны чырвоным колерам (р <0,05 і розніца ў інтэнсіўнасці іёнаў> у 2 разы). Значна змененыя вавёркі вылучаны чырвоным колерам (р <0,05 і розніца ў інтэнсіўнасці іёнаў> у 2 разы). Значна змененыя белкі вылучаныя чырвоным колерам (p < 0,05 і >2-кратная разніца ў інтэнсіўнасці іёнаў). Значна змененыя вавёркі вылучаны чырвоным колерам (p <0,05 і> 2-кратная розніца ў інтэнсіўнасці іёнаў).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异＂).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значна змененыя белкі вылучаны чырвоным колерам (p < 0,05 і > 2-кратная разніца ў іённай сіле). Значна змененыя вавёркі вылучаны чырвоным колерам (p <0,05 і> 2-кратная розніца ў іённай сіле).Роднасныя бялкі, важныя для HEK293T-miniSOG, але не важныя для HEK293T, паказаны зялёным колерам.e Аналіз спецыфічнасці пратэёмных набораў даных з эксперыментаў d.Агульная колькасць статыстычна значных бялкоў у кожнай арганэл (чырвоныя і зялёныя кропкі) адзначана ўверсе.Гістаграмы паказваюць бялкі, лакалізаваныя ў арганэл на аснове MitoCarta 3.0, аналізу GO і A. Ting et al.людзей.Асобныя наборы даных для мітахондрый, ядраў і ER.Гэтыя эксперыменты былі незалежна паўтараны як мінімум два разы з аналагічнымі вынікамі.Неапрацаваныя даныя прадастаўляюцца ў выглядзе файлаў неапрацаваных даных.
Натхнёныя вынікамі геля і візуалізацыі, колькаснае вызначэнне без этыкетак было выкарыстана для колькаснага вызначэння ідэнтыфікаванага пратэома ў кожнай арганэле (дадатковыя дадзеныя 2).Нетрансфектированный HEK293T быў выкарыстаны ў якасці адмоўнага кантролю для аднімання фонавых маркераў. Аналіз графіка вулкана выявіў значнае ўзбагачэнне бялкоў (p <0,05 і >2-кратная інтэнсіўнасць іёнаў), а таксама адзінкавыя вавёркі, якія прысутнічаюць толькі ў лініях, якія экспрэсуюць miniSOG (мал. 3d, чырвоныя і зялёныя кропкі). Аналіз графіка вулкана выявіў значнае ўзбагачэнне бялкоў (p <0,05 і >2-кратная інтэнсіўнасць іёнаў), а таксама адзінкавыя вавёркі, якія прысутнічаюць толькі ў лініях, якія экспрэсуюць miniSOG (мал. 3d, чырвоныя і зялёныя кропкі). Аналіз графіка вулкана паказаў значна узбагачаныя белкі (p <0, 05 і > 2-кратная інтэнсіўнасць іёнаў), а таксама адзінкавыя белкі, якія прысутнічаюць толькі ў лініях, якія экспрэсуюць miniSOG (рыс. 3d, чырвоныя і зялёныя кропкі). Аналіз графіка вулкана паказаў значнае ўзбагачэнне бялкоў (p<0,05 і >2-кратная інтэнсіўнасць іёнаў), а таксама адзінкавыя вавёркі, якія прысутнічаюць толькі ў лініях, якія экспрэсуюць miniSOG (мал. 3d, чырвоныя і зялёныя кропкі).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Аналіз графікі вулкана выявіў значна ўзбагачаныя белкі (p <0, 05 і> 2x іённая сіла), а таксама асобныя белкі, якія прысутнічаюць толькі ў экспрэсійнай лініі miniSOG (чырвоныя і зялёныя кропкі на рыс. 3d). Аналіз графіка вулкана выявіў значнае ўзбагачэнне бялкоў (p<0,05 і >2x іённай сілы), а таксама адзінкавыя вавёркі, якія прысутнічаюць толькі ў лініі экспрэсіі miniSOG (чырвоныя і зялёныя кропкі на мал. 3d).Аб'яднаўшы гэтыя дадзеныя, мы вызначылі 1364, 461 і 911 статыстычна значных ядзерных, мітахандрыяльных і вонкавых мембранных бялкоў ER адпаведна.Каб прааналізаваць дакладнасць PDPL з лакалізацыяй арганэл, мы выкарыстоўвалі MitoCarta 3.0, аналіз геннай анталогіі (GO) і A. Ting et al.набор дадзеных8 быў выкарыстаны для мітахондрый, ядра і ER для праверкі спецыфічнасці арганэл выяўленых бялкоў, што адпавядае дакладнасці 73,4, 78,5 і 73,0% (мал. 3e).Спецыфіка PDPL пацвярджае, што PDPL з'яўляецца ідэальным інструментам для ідэнтыфікацыі пратэёмаў, спецыфічных для арганэл.Характэрна, што субмітахандрыяльны аналіз ідэнтыфікаваных мітахандрыяльных бялкоў паказаў, што захоплены пратэём у асноўным размеркаваны ў матрікса і ўнутранай мембране (226 і 106 адпаведна), што складае 91,7% (362) ад агульнай колькасці ідэнтыфікаваных мітахандрыяльных бялкоў.быў дадаткова пацверджаны высокі ўзровень PDPL (дадатковы малюнак 7а).Аналагічным чынам суб'ядзерны аналіз паказаў, што захоплены пратэём у асноўным размеркаваны ў ядры, нуклеаплазме і ядзерку (дадатковы мал. 7b).Ядзерны пратэёмны аналіз з сігнальным пептыдам ядзернай лакалізацыі (3xNLS) паказаў аналагічную дакладнасць канструкцыі H2B (дадатковы малюнак 7c–h).Каб вызначыць спецыфічнасць маркера PDPL, ядзерны ламінін A быў абраны ў якасці больш дыскрэтна лакалізаванай пасткі POI7.PDPL вызначыў 36 значна ўзбагачаных бялкоў, з якіх 12 бялкоў (30,0 % у тым ліку ламін А) былі добра ахарактарызаванымі вавёркамі, якія ўзаемадзейнічаюць з ламінам А, анатаваны базай дадзеных String, з больш высокім адсоткам, чым метад BioID (122 бялкі) 28 з 28. , 22,9 %) 7. Наш метад вызначыў менш бялкоў, магчыма, з-за абмежаваных абласцей маркіроўкі, што стала магчымым дзякуючы больш актыўнаму сінглетнаму кіслароду.Аналіз GO паказаў, што выяўленыя вавёркі ў асноўным размешчаны ў нуклеаплазме (26), ядзернай мембране (10), ядзернай мембране (9) і ядзерных порах (5).У сукупнасці гэтыя бялкі, лакалізаваныя ў ядры, складалі 80% узбагачаных бялкоў, што дадаткова дэманструе спецыфічнасць PDPL (дадатковы малюнак 8a–d).
Усталяваўшы здольнасць PDPL выконваць маркіроўку блізкасці ў арганэлах, мы праверылі, ці можна выкарыстоўваць PDPL для аналізу партнёраў па звязванні POI.У прыватнасці, мы імкнуліся вызначыць аналіз PDPL цытазольных бялкоў, якія лічацца больш складанымі мішэнямі, чым іх мембранна-лакалізаваныя аналагі з-за іх вельмі дынамічнай прыроды.Бромадамен і экстратэрмінальны (BET) бялок BRD4 прыцягнуў нашу ўвагу сваёй ключавой роляй у розных захворваннях 35, 36.Комплекс, утвораны BRD4, з'яўляецца коактиватором транскрыпцыі і важнай тэрапеўтычнай мішэнню.Рэгулюючы экспрэсію фактараў транскрыпцыі c-myc і Wnt5a, BRD4 лічыцца ключавым фактарам, які вызначае востры міелалейкоз (ОМЛ), множную міелому, лімфаму Беркіта, рак тоўстай кішкі і запаленчыя захворванні37,38.Акрамя таго, некаторыя вірусы, такія як вірус папіломы, ВІЧ і SARS-CoV-236,39, накіраваны на BRD4 для рэгулявання віруснай і клеткавай транскрыпцыі.
Каб адлюстраваць ўзаемадзеянне BRD4 з дапамогай PDPL, мы аб'ядналі miniSOG з кароткай N- або C-канцавой ізаформай BRD4.Пратэёмныя вынікі паказалі высокую ступень перакрыцця паміж двума канструкцыямі (дадатковая мал. 9а).Ядзерны пратэом, ідэнтыфікаваны з miniSOG-H2B, ахоплівае 77,6% бялкоў, якія ўзаемадзейнічаюць з BRD4 (дадатковы малюнак 9b).Затым, розны час асвятлення (2, 5, 10, 20 мін) былі выкарыстаны для рэгулявання радыусу маркера (мал. 4а і дадатковыя дадзеныя 3).Мы прыходзім да высновы, што пры больш кароткіх фотаперыядах PDPL будзе ў першую чаргу пазначаць прамых партнёраў звязвання, у той час як больш працяглыя перыяды будуць уключаць вавёркі, выяўленыя падчас больш кароткіх перыядаў фотаактывацыі, а таксама ўскосныя мішэні ў комплексах маркіроўкі.Фактычна, мы выявілі моцнае перакрыцце паміж сумежнымі момантамі часу (84,6% на працягу 2 і 5 хвілін; 87,7% на працягу 5 і 10 хвілін; 98,7% на працягу 10 і 20 хвілін) (мал. 4b і дадатковы малюнак 9c).Ва ўсіх эксперыментальных групах мы выявілі не толькі самамаркіроўку BRD4, але і некалькі вядомых мішэняў, такіх як MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A і HMGB1, анатаваных у базе дадзеных радкоў.Іённая сіла гэтых мішэняў прапарцыйная часу ўздзеяння (мал. 4c і дадатковы малюнак 9d).Аналіз GO бялкоў, ідэнтыфікаваных у 2-хвіліннай групе, паказаў, што ідэнтыфікаваныя вавёркі лакалізаваны ў ядры і ўдзельнічаюць у рэмадэляванні храмаціну і функцыі РНК-палімеразы.Малекулярная функцыя бялку была ўзбагачана звязваннем храмаціну або коактивацией транскрыпцыі, што адпавядае функцыі BRD4 (мал. 4d).Аналіз узаемадзеяння бялку з падтрымкай базы дадзеных радкоў выявіў першы ўзровень непрамых узаемадзеянняў паміж комплексамі BRD4 і сямейства HDAC, якія ўзаемадзейнічаюць такімі як SIN3A, NCOR2, BCOR і SAP130 (мал. 4e і дадатковы малюнак 9e), што адпавядае BRD4 і HDAC, якія звязваюць ацэтыляваныя гістоны ..Акрамя таго, рэпрэзентатыўныя мэты, ідэнтыфікаваныя LC-MS/MS, у тым ліку Sin3A, NSUN2, Fus і SFPQ, былі пацверджаны Вестэрн-блоттингом (мал. 4f).Нядаўна паведамлялася, што кароткая ізаформа BRD4 утварае ядра са ўласцівасцямі падзелу фаз вадкасць-вадкасць (LLPS).Вавёркі, якія звязваюць РНК, Fus і SFPQ, апасродкуюць LLPS розных клеткавых працэсаў і былі ідэнтыфікаваны тут як незарэгістраваныя вавёркі, якія звязваюць BRD4.Узаемадзеянне паміж BRD4 і SFPQ было пацверджана эксперыментамі па сумеснай імунапрэцыпітацыі (co-IP) (малюнак 4g), што сведчыць пра іншы механізм падзелу фаз вадкасць-вадкасць, апасродкаваны BRD4, які заслугоўвае далейшага даследавання.У сукупнасці гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што PDPL з'яўляецца ідэальнай платформай для ідэнтыфікацыі вядомых узаемадзеянняў BRD4, а таксама невядомых звязваючых бялкоў.
Схематычнае адлюстраванне маркіроўкі блізкасці BRD4, апасродкаванай miniSOG, час уздзеяння: 2, 5, 10 і 20 хвілін.b Перакрыцце бялкоў, выяўленых у розны час асвятлення.Узбагачэнне бялком, выяўленае ў HEK293T-miniSOG-BRD4, было статыстычна значным у параўнанні з HEK293T дзікага тыпу.c Інтэнсіўнасць іёнаў пры колькасным вызначэнні немечаных рэпрэзентатыўных вядомых BRD4-звязваючых бялкоў на працягу вызначанага часу ўздзеяння.n = 3 біялагічна незалежных пробы.Дадзеныя прадстаўлены як сярэдняе ± стандартнае адхіленне.d Анталагічны аналіз генаў (GO) бялкоў, выяўленых у 2-хвіліннай групе.Пералічаны першыя дзесяць тэрмінаў GO.Бурбалкі афарбаваны ў адпаведнасці з катэгорыяй тэрміна GO, а памер бурбалкі прапарцыйны колькасці бялкоў, знойдзеных у кожным тэрміне.e Струнны аналіз бялкоў, якія ўзаемадзейнічаюць з BRD4.Жоўтыя кругі - гэта прамы клей, а шэрыя - першы пласт непрамога клею.Чырвоныя лініі азначаюць эксперыментальна вызначаныя ўзаемадзеянні, а сінія - прадказаныя ўзаемадзеянні.f Рэпрэзентатыўныя мішэні звязвання BRD4, выяўленыя ў LC-MS/MS, былі правераны Вестэрн-блотінгам.g Эксперыменты сумеснай імунапрэцыпітацыі пацвярджаюць узаемадзеянне паміж SFPQ і BRD4.Гэтыя эксперыменты былі незалежна паўтараны як мінімум два разы з аналагічнымі вынікамі.Неапрацаваныя даныя прадастаўляюцца ў выглядзе файлаў неапрацаваных даных.
У дадатак да ідэнтыфікацыі незарэгістраваных мішэняў, звязаных з POI, мы мяркуем, што PDPL будзе прыдатным для ідэнтыфікацыі субстратаў для ферментаў, што запатрабуе характарыстыкі ўскосных звязваючых бялкоў у вялікіх комплексах для анатавання незарэгістраваных субстратаў.Parkin (закадаваны PARK2) - гэта лігаза E3, і вядома, што мутацыі паркіна выклікаюць аўтасомна-рэцэсіўную ювенільную хваробу Паркінсана (AR-JP)42.Акрамя таго, паркін быў апісаны як неабходны для мітафагіі (мітахандрыяльнай аўтафагіі) і выдалення актыўных формаў кіслароду.Аднак, хоць было ідэнтыфікавана некалькі субстратаў паркіна, роля паркіна ў гэтай хваробы застаецца незразумелай.Каб анатаваць яго неахарактарызаваныя субстраты, PDPL быў пратэставаны шляхам дадання miniSOG да N- або C-канца паркіна.Клеткі апрацоўвалі м-хлорфенілгідразонам, пераносчыкам пратонаў карбанільнага цыяніду (CCCP), каб актываваць паркін па шляху PINK1-Parkin.У параўнанні з нашымі вынікамі BRD4 PDPL, зліццё N-канца паркіна выявіла большы набор бялкоў-мішэняў, хоць яно ахоплівала большую частку С-канца (177 з 210) (малюнак 5a,b і дадатковыя дадзеныя 4).вынік супадае з паведамленнямі аб тым, што N-канцавыя тэгі могуць аберрантна актываваць Parkin44.Дзіўна, але ў нашых дадзеных з апублікаванымі вынікамі AP-MS для Parkin43 было толькі 18 бялкоў, якія перакрываюцца, верагодна, з-за адрозненняў паміж клеткавымі лініямі і працоўнымі працэсамі пратэёмікі.У дадатак да чатырох вядомых бялкоў (ARDM1, HSPA8, PSMD14 і PSMC3), выяўленых двума метадамі (мал. 5c)43.Для далейшай праверкі вынікаў ВХ-МС/МС для параўнання вынікаў аналізу бацькоўскіх клетак HEK293T і стабільнай N-канцавой лініі Паркіна выкарыстоўвалася апрацоўка PDPL і наступны вестэрн-блот.Раней невядомыя мішэні CDK2, DUT, CTBP1 і PSMC4 былі пратэставаны з вядомым злучным рэчывам DNAJB1 (мал. 5d).
Вулканічны графік бялкоў, якія ўзаемадзейнічаюць з паркінам, у клетках HEK293T са стабільна выяўленым miniSOG, злітым з N- або C-канцам паркіна (n = 3 незалежных біялагічных эксперыменту).Двухбаковы t-крытэр Ст'юдэнта выкарыстоўваўся на графіках вулканаў.HEK293T быў выкарыстаны ў якасці адмоўнага кантролю. Значна змененыя вавёркі вылучаны чырвоным колерам (р <0,05 і розніца ў інтэнсіўнасці іёнаў> у 2 разы). Значна змененыя вавёркі вылучаны чырвоным колерам (р <0,05 і розніца ў інтэнсіўнасці іёнаў> у 2 разы). Значна змененыя белкі вылучаныя чырвоным колерам (p < 0,05 і >2-кратная разніца ў інтэнсіўнасці іёнаў). Значна змененыя вавёркі вылучаны чырвоным колерам (p <0,05 і> 2-кратная розніца ў інтэнсіўнасці іёнаў).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异＂).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значна змененыя белкі вылучаны чырвоным колерам (p < 0,05 і > 2-кратная разніца ў іённай сіле). Значна змененыя вавёркі вылучаны чырвоным колерам (p <0,05 і> 2-кратная розніца ў іённай сіле).Роднасныя бялкі, важныя для HEK293T-miniSOG, але не важныя для HEK293T, паказаны зялёным колерам.b Дыяграма Венна, якая паказвае вавёркі, якія перакрываюцца паміж N-канцавымі і С-канцавымі канструкцыямі.N-канцавыя тэгі могуць аберрантна актываваць паркін і прывесці да больш пазнавальных бялкоў.c Дыяграма Венна, якая паказвае вавёркі, якія перакрываюцца паміж PDPL і AP-MS.Пералічаны вядомыя ўзаемадзеянні, у тым ліку 4 з 18 бялкоў, якія перакрываюцца, і 11 з 159 бялкоў, спецыяльна вызначаных у PDPL.d Рэпрэзентатыўныя мішэні, ідэнтыфікаваныя з дапамогай LC-MS/MS, былі правераны Вестэрн-блотінгам.e Ssu72 і SNW1 былі вызначаны як незарэгістраваныя субстраты паркіна.Гэтыя бялковыя плазміды, пазначаныя FLAG, трансфікавалі ў HEK293T і HEK293T-Parkin-miniSOG з наступнай апрацоўкай CCCP у розныя моманты часу.Дэградацыя была больш выяўленай у лініі гиперэкспрессии Паркіна.f Выкарыстоўваючы інгібітар пратэасомы MG132, было пацверджана, што працэс дэградацыі Ssu72 і SNW1 апасродкаваны ўбіквітынацыяй пратэасомы.Гэтыя эксперыменты былі незалежна паўтараны як мінімум два разы з аналагічнымі вынікамі.Неапрацаваныя даныя прадастаўляюцца ў выглядзе файлаў неапрацаваных даных.
Характэрна, што вавёркі, ідэнтыфікаваныя PDPL, павінны ўключаць вавёркі, якія звязваюць паркін, і іх субстраты.Для выяўлення незарэгістраваных субстратаў паркіна мы абралі сем ідэнтыфікаваных бялкоў (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 і SNW1) і трансфекцыю плазмід, каб падвергнуць гэтыя гены нармальнаму HEK293T і стабільна экспрэсаваць HEK293T miniSOG-Parkin з наступнай апрацоўкай CCCP.Ўзроўні бялкоў Ssu72 і SNW1 былі значна зніжаны ў стабільнай лініі miniSOG-Parkin (мал. 5e).Апрацоўка CCCP на працягу 12 гадзін прывяла да найбольш значнай дэградацыі абодвух субстратаў.Каб даследаваць, ці рэгулюецца дэградацыя Ssu72 і SNW1 убиквитинированием протеасом, інгібітар протеасом MG132 быў дададзены для інгібіравання актыўнасці протеасом, і на самай справе мы выявілі, што працэс іх дэградацыі інгібіруецца (мал. 5f).Дадатковыя несубстратныя мішэні былі пацверджаны як узаемадзеяльнікі Паркіна з дапамогай Вестэрн-блот (дадатковы малюнак 10), які паказаў паслядоўныя вынікі з ВХ-МС/МС.У заключэнне, інтэграцыя працоўнага працэсу PDPL з праверкай трансфекцыі мэтавага бялку дазваляе ідэнтыфікаваць незарэгістраваныя субстраты лигазы E3.
Мы распрацавалі агульную платформу маркіроўкі блізкасці, якая дазваляе ідэнтыфікаваць у прасторы і часе ўзаемадзейнічаючыя POI.Платформа заснавана на бялку фотасенсібілізатара miniSOG, які складае ўсяго каля 12 кДа, што складае менш за палову памеру спелага фермента APEX2 (27 кДа) і на траціну памеру TurboID (35 кДа).Меншы памер павінен значна пашырыць дыяпазон прымянення для вывучэння малых бялковых інтэрактомаў.Каб павялічыць квантавы выхад сінглетнага кіслароду і пашырыць адчувальнасць гэтага падыходу, неабходна далейшае даследаванне дадатковых фотасенсібілізатараў, незалежна ад таго, генетычна закадзіраваныя вавёркі або малыя малекулы.Для бягучай версіі miniSOG высокае часовае раздзяленне можа быць дасягнута з дапамогай блакітнага асвятлення для актывацыі маркераў набліжэння.Акрамя таго, большы час экспазіцыі вызваляў большае «воблака» сінглетнага кіслароду, што прывяло да мадыфікацыі больш дыстальных рэшткаў гістідіна, павелічэння радыусу маркіроўкі і магчымасці тонкай налады прасторавага дазволу PDPL.Мы таксама пратэставалі сем хімічных зондаў для павелічэння суадносін сігналу і фону і вывучылі малекулярны механізм гэтага падыходу.Рабочы працэс TOP-ABPP у спалучэнні з аб'ектыўным адкрытым пошукам пацвердзіў, што мадыфікацыі адбываюцца толькі ў гістыдынах і не назіраецца паслядоўнага мікраасяроддзя для павелічэння мадыфікацый гістыдыну, за выключэннем умеранай перавагі гістыдынаў у вобласці завесы.
PDPL таксама выкарыстоўваўся для характарыстыкі субклеткавых пратэомаў са спецыфічнасцю пратэома і ахопам, па меншай меры, параўнальным з іншымі метадамі блізкага маркіравання і арганэл-спецыфічных хімічных зондаў.Маркеры блізкасці таксама былі паспяхова выкарыстаны для характарыстыкі павярхоўных, лизосомальных і звязаных з секретомами протеомов46,47.Мы лічым, што PDPL будзе сумяшчальны з гэтымі субклеткавых арганэл.Акрамя таго, мы кінулі выклік PDPL, вызначыўшы мішэні для звязвання цытазольнага бялку, якія з'яўляюцца больш складанымі, чым звязаныя з мембранай вавёркі, дзякуючы іх дынамічным уласцівасцям і ўдзелу ў больш часавых узаемадзеяннях.PDPL быў ужыты да двух бялкоў, каактыватара транскрыпцыі BRD4 і асацыяванай з хваробай лігазы E3 Parkin.Гэтыя два бялку былі выбраны не толькі з-за іх асноўных біялагічных функцый, але і з-за іх клінічнай значнасці і тэрапеўтычнага патэнцыялу.Для гэтых двух POI былі вызначаны вядомыя абавязковыя партнёры, а таксама незарэгістраваныя мэты.Характэрна, што бялок SFPQ, звязаны з падзелам фаз, быў пацверджаны з дапамогай ко-ІП, што можа паказваць на новы механізм, з дапамогай якога BRD4 (кароткая ізаформа) рэгулюе LLPS.У той жа час мы лічым, што ідэнтыфікацыя падкладак Parkin - гэта сцэнар, пры якім патрабуецца ідэнтыфікацыя непрамых клеяў.Мы ідэнтыфікавалі два неапазнаных субстрата паркіна і пацвердзілі іх дэградацыю па шляху ўбіквітызацыі-пратэасомы.Нядаўна была распрацавана заснаваная на механізме стратэгія адлову для выяўлення гідралазных субстратаў шляхам адлоўлівання іх ферментамі.Хоць гэта вельмі магутны метад, ён не падыходзіць для аналізу субстратаў, якія ўдзельнічаюць у адукацыі вялікіх комплексаў, і патрабуе адукацыі кавалентных сувязяў паміж ферментам і субстратам.Мы чакаем, што PDPL можа быць пашыраны для вывучэння іншых бялковых комплексаў і сямействаў ферментаў, такіх як сем'і деубиквитиназ і металапратэаз.
Новая форма miniSOG пад назвай SOPP3 была распрацавана з паляпшэннем выпрацоўкі сінглетнага кіслароду.Мы параўналі miniSOG з SOPP3 і выявілі паляпшэнне характарыстык маркіроўкі, хаця стаўленне сігнал/шум засталося нязменным (дадатковы малюнак 11).Мы выказалі здагадку, што аптымізацыя SOPP3 (напрыклад, праз накіраваную эвалюцыю) прывядзе да больш эфектыўных бялкоў-фотасенсібілізатараў, якія патрабуюць больш кароткага часу асвятлення і, такім чынам, дазваляюць фіксаваць больш дынамічныя клеткавыя працэсы.Характэрна, што цяперашняя версія PDPL абмежаваная клеткавым асяроддзем, паколькі патрабуе асвятлення сінім святлом і не можа пранікаць у глыбокія тканіны.Гэта асаблівасць выключае яго выкарыстанне ў даследаваннях на мадэлях на жывёл.Аднак спалучэнне оптагенетыкі з PDPL можа даць магчымасць для даследаванняў на жывёл, асабліва ў галаўным мозгу.Акрамя таго, іншыя распрацаваныя інфрачырвоныя фотасенсібілізатары таксама здымаюць гэта абмежаванне.Зараз праводзяцца даследаванні ў гэтай галіне.
Лінія клетак HEK293T была атрымана ад ATCC (CRL-3216).Лінія клетак дала адмоўны вынік на мікоплазменную інфекцыю і культывавалася ў DMEM (Thermo, #C11995500BT) з даданнем 10% фетальной бычынай сыроваткі (FBS, Vistech, #SE100-B) і 1% пеніцыліну/стрэптаміцыну (Hyclone, #SV30010).вырас у.
3-аминофенилен (узор 3) і (4-этинилфенил) метанамін (узор 4) былі набыты ў Bidepharm.Прапіламін (зонд 2) быў набыты ў Energy-chemicals.N-(2-амінафеніл)пент-4-інамід (зонд 1) быў сінтэзаваны ў адпаведнасці з апублікаванымі метадамі.
У дадатковай табліцы 1 пералічаны генетычныя канструкцыі, выкарыстаныя ў гэтым даследаванні.Паслядоўнасці miniSOG і KillerRed былі кланаваныя з падарункавай плазміды ад P. Zou (Пекінскі універсітэт).Мэтавая паслядоўнасць мітахандрыяльнай матрыцы была атрымана з 23 N-канцавых амінакіслот ЦОГ4 і кланавана ў пазначаныя вектары з дапамогай зборкі Гібсана (Beyotime, #D7010S).Для нацэльвання на мембрану і ядро эндаплазматычнага рэтыкулума ДНК чалавека SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), ампліфікаваная з дапамогай ПЦР з бібліятэкі кДНК клетак HEK293T, і ДНК H2B (ахвяраваная Д. Лінам, лабараторыя Шэньчжэньскага заліва) і кланаваны, як згадвалася вышэй.Калі не пазначана іншае, іншыя бялковыя гены, якія выкарыстоўваліся для трансфекцыі і канструявання стабільных клеткавых ліній, былі ПЦР-ампліфікаваны з бібліятэкі кДНК клетак HEK293T.G3S (GGGS) і G4S (GGGGS) выкарыстоўваліся ў якасці лінкераў паміж бялком прынады і miniSOG.Тэг эпітопа V5 (GKPIPNPLLGLDST) быў дададзены да гэтых злітых канструкцый.Для экспрэсіі ў млекакормячых і стварэння стабільнай клетачнай лініі злітую канструкцыю miniSOG субкланавалі ў лентывірусны вектар pLX304.Для бактэрыяльнай экспрэсіі miniSOG быў кланаваны ў вектар pET21a, пазначаны 6xHis на С-канцы.
Клеткі HEK293T высейваюць па 2,0 х 105 клетак на лунку ў шасцілункавыя пласціны і праз 24 гадзіны трансфікуюць рэкамбінантнымі лентывіруснымі плазмідамі (2,4 мкг pLX304) і плазмідамі для ўпакоўкі вірусаў (1,5 мкг psPAX2 і 1,2 мкг pMD2.G) з выкарыстаннем Lipo8000 (Beyotime). , #C0533), каля 80% зліцця.Пасля начной трансфекцыі сераду мянялі і інкубавалі яшчэ 24 гадзіны.Збор віруса праводзілі праз 24, 48 і 72 гадзіны.Перад заражэннем клеткавых ліній-мішэняў віруснае асяроддзе фільтравалі праз фільтр 0,8 мкм (Merck, #millex-GP) і дадавалі полибрен (Solarbio, #H8761) да канцэнтрацыі 8 мкг/мл.Праз 24 гадзіны клеткам далі аднавіцца, змяніўшы асяроддзе.Клеткі адбіралі з выкарыстаннем 5 мкг/мл бластыцыдыну (Solarbio, № 3513-03-9) для першых трох пасажаў у якасці менш строгага адбору.Затым выкарыстоўвалі 20 мкг / мл у якасці больш строгага рэжыму для наступных трох пасажаў.
Клеткі высейвалі ў 12-лункавыя камеры (Ibidi, #81201) пры шчыльнасці прыкладна 20 000 клетак на лунку.Каб палепшыць адгезію клетак HEK293T, дадайце 50 мкг/мл фібранектыну (Corning, #356008), разведзенага ў фасфатным буферным растворы (PBS, Sangon, #B640435) пры 37°C.Камеры былі папярэдне апрацаваны на працягу 1 гадзіны, а затым выдалены PBS.Праз 24 гадзіны клеткі прамывалі адзін раз PBS, інкубавалі з 1 мМ зондам 3 у свежым збалансаваным растворы солі Хэнкса (HBSS, Gibco, № 14025092) на працягу 1 гадзіны пры 37 °C, а затым інкубавалі з сінім святлодыёдам (460 нм). ).) апраменьвалі на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Пасля гэтага клеткі двойчы прамывалі PBS і фіксавалі 4% фармальдэгідам у PBS (Sangon, #E672002) на працягу 15 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Лішак фармальдэгіду выдалялі з фіксаваных клетак шляхам трохразовага прамывання PBS.Затым клеткі пермеабилизированы 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) у PBS і прамытыя 3 разы PBS.Затым зніміце камеру і дадайце да кожнага ўзору 25 мкл рэакцыйнай сумесі, якая змяшчае 50 мкМ Cy3-азіду (Aladdin, #C196720), 2 мм CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 мм BTTAA (Confluore, #BDJ-4). і 0,5 мг/мл аскорбата натрыю (Aladdin, № S105024) і інкубавалі 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Пасля імгненнай рэакцыі клеткі шэсць разоў прамывалі PBS, які змяшчае 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST), а затым блакавалі 5% BSA (Abcone, #B24726) у PBST на працягу 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.
Для імуннага афарбоўвання пры колокализации клеткі інкубавалі з першаснымі антыцеламі ў адпаведнасці з указанымі ўмовамі: мышыныя mAb супраць тэга V5 (1:500, CST, #80076), трусіныя mAb супраць Hsp60 (1:1000), ABclonal, #A0564), трусіныя поліклональныя антыцелы супраць калнексіну (1:500, Abcam, #ab22595) або трусіныя моноклональные антыцелы супраць ламіна A/C (1:500; CST, #2032) пры 4 °C на працягу ночы.Пасля трохразовага прамывання PBST клеткі інкубавалі з другаснымі антыцеламі: казіным анты-трусіным Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034), разведзеным 1:1000, казіным анты-мышыным Alexa Fluor 594 (CST, #8889), разведзеным 1:1000.развядзенне Развесці пры пакаёвай тэмпературы 30 хвілін.Затым клеткі прамывалі 3 разы PBST і контрафарбоўвалі DAPI (Thermo, #D1306) у PBS на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Пасля 3 прамыванняў PBS клеткі запячатвалі ў 50% гліцэрыне (Sangon, #A600232) у PBS для візуалізацыі.Иммунофлуоресцентные выявы былі атрыманы з дапамогай канфакальнага мікраскопа ZEISS LSM 900 Airyscan2 і праграмнага забеспячэння ZNE 3.5.
Для флюарэсцэнтнай візуалізацыі сінглетнага кіслароду клеткі двойчы прамывалі буферам Хэнкса HEPES перад даданнем 100 нМ Si-DMA у буфер Хэнкса HEPES (DOJINDO, #MT05).Пасля ўздзеяння святла клеткі інкубавалі ў CO2-інкубатары пры 37 ° C на працягу 45 хвілін.Затым клеткі двойчы прамывалі буферам HEPES Хэнкса і афарбоўвалі Hoechst у буферы HEPES Хэнкса на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы і візуалізавалі з дапамогай канфакальнага мікраскопа ZEISS LSM 900., #M36008) у буферы HBSS, які змяшчае кальцый і магній.Пасля ўздзеяння святла або доксарубіцыну (MCE, #HY-15142A) клеткі інкубавалі ў CO2-інкубатары пры 37°C на працягу 10 хвілін, двойчы прамывалі буферам HBSS і інкубавалі з Hoechst у буферы HBSS пры пакаёвай тэмпературы.хвілін.Доксарубіцын выкарыстоўвалі ў якасці станоўчага кантролю зонда, дзе клеткі апрацоўвалі 20 мкМ доксарубіцыну ў HBSS, які змяшчае 1% BSA, на працягу 30 хвілін.Иммунофлуоресцентные выявы былі атрыманы з дапамогай канфакальнага мікраскопа Zeiss LSM 900.
Клеткі HEK293T, стабільна экспрессирующие mito-miniSOG, высейвалі пры шчыльнасці прыкладна 30% у 15-сантыметровыя чашкі.Праз 48 гадзін, калі было дасягнута ~80% канфлюэнтнасці, клеткі адзін раз прамывалі PBS, інкубавалі з 1 мМ зондам 3 у свежым буферы HBSS на працягу 1 гадзіны пры 37°C, а затым асвятлялі сінім святлодыёдам на працягу 10 хвілін у пакоі. тэмпература..Пасля гэтага клеткі двойчы прамывалі PBS, саскрабалі і ресуспендировали ў ледзяным буферы PBS, які змяшчае інгібітары пратэазы без ЭДТА (MCE, #HY-K0011).Клеткі лізіравалі ультрагукам наканечнік на працягу 1 хвіліны (1 секунда ўключана і 1 секунда выключана пры 35% амплітудзе).Атрыманую сумесь центрифугировали пры 15,871 xg на працягу 10 хвілін пры 4°C для выдалення рэшткаў, а канцэнтрацыю супернатанта даводзілі да 4 мг/мл з дапамогай набору для аналізу бялку BCA (Beyotime, #P0009).Змяшайце 1 мл вышэйпаказанага лізата з 0,1 ммоль фотараскладальнага біятын-азіду (Confluore, #BBBD-14), 1 ммоль TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 ммоль ліганда TBTA (Aladdin, #T162437) і 1 ммоль CuSO4 інкубатар з дном круціцца на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы.Пасля імгненнай рэакцыі дадайце сумесь да папярэдне змешанага раствора (MeOH:CHCl3:H2O = 4 мл:1 мл:3 мл) у шкляны флакон на 10 мл.Узоры змешвалі і центрифугировали пры 4500 g на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Ніжні і верхні растворы адкідвалі, асадак двойчы прамывалі 1 мл метанолу і центрифугировали пры 15871 × g на працягу 5 хвілін пры 4 ° С.Дадайце 1 мл 8 М мачавіны (Aladdin, № U111902) у 25 мм бікарбанату амонія (ABC, Aladdin, № A110539), каб растварыць асадак.Узоры аднаўлялі 10 мМ дитиотреитола (Sangon, #A100281 у 25 мМ ABC) на працягу 40 хвілін пры 55°C з наступным даданнем 15 мМ свежага йодацетамида (Sangon, #A600539) пры пакаёвай тэмпературы ў цемры.Алкілаванне на працягу 30 хвілін..Для спынення рэакцыі дадаюць дадатковыя 5 мМ дитиотреитола.Прыгатуйце прыблізна 100 мкл агарозных шарыкаў NeutrAvidin (Thermo, № 29202) для кожнага ўзору, прамыўшы 3 разы 1 мл PBS.Вышэйзгаданы раствор пратэёма разбаўлялі 5 мл PBS і інкубавалі з папярэдне прамытымі агарознымі шарыкамі NeutrAvidin на працягу 4 гадзін пры пакаёвай тэмпературы.Затым шарыкі прамывалі 3 разы 5 мл PBS, які змяшчае 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 разы 5 мл PBS, які змяшчае 1M мачавіну, і 3 разы 5 мл ddH2O.Затым шарыкі збіралі цэнтрыфугаваннем і ресуспендировали ў 200 мкл 25 мм ABC, які змяшчае 1 М мачавіны, 1 мм CaCl 2 (Macklin, # C805228) і 20 НГ / мкл трыпсінаў (Promega, # V5280).Трипсинизируйте на працягу ночы пры 37°C з кручэннем.Рэакцыю спынялі даданнем мурашынай кіслаты (Thermo, # A117-50), пакуль рн не дасягне 2-3.Шарыкі прамывалі 3 разы 1 мл PBS, які змяшчае 0,2% SDS, 3 разы 1 мл PBS, які змяшчае 1 М мачавіны, а затым 3 разы 1 мл дыстыляванай вады.Мадыфікаваныя пептыды вызвалялі светлавым лізіс (365 нм) на працягу 90 хвілін з выкарыстаннем 200 мкл 70% метанолу.Пасля цэнтрыфугавання адбіралі супернатант.Затым шарыкі прамывалі адзін раз 100 мкл 70% метанолу і супернатанты аб'ядноўвалі.Узоры сушылі ў вакуумным канцэнтратары Speedvac і захоўвалі пры -20°C да аналізу.
Для ідэнтыфікацыі і колькаснай ацэнкі мадыфікаваных сінглетным кіслародам пептыдаў узоры паўторна растваралі ў 0,1% мурашынай кіслаты і 1 мкг пептыдаў аналізавалі з дапамогай мас-спектрометра Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, абсталяванага нанакрыніцай ESI ад Tune і Xcalibur ад пастаўшчыка праграмнага забеспячэння 4.3.Узоры былі падзелены на капілярнай калонцы з унутранай напоўненасцю 75 мкм × 15 см з матэрыялам C18 3 мкм (ReproSil-pur, #r13.b9.) і падлучаны да сістэмы EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Пептыды падзялялі з дапамогай лінейнай 95-хвіліннай градыентнай храматаграфіі ад 8% растваральніка B да 50% растваральніка B (A = 0,1% мурашынай кіслаты ў вадзе, B = 0,1% мурашынай кіслаты ў 80% ацэтанітрыле), затым лінейна павялічвалі да 98% B мін. праз 6 мін пры расходзе 300 нл/мін.Orbitrap Fusion Lumos збірае даныя па чарзе паміж поўным сканаваннем MS і сканаваннем MS2 у залежнасці ад даных.Напружанне распылення было ўстаноўлена на 2,1 кВ, а тэмпература іённага транспартнага капіляра была роўная 320 °C.Спектры МС (350-2000 m/z) збіраліся з дазволам 120 000, AGC 4 × 105 і максімальным часам уводу 150 мс.10 найбольш распаўсюджаных шматзарадных папярэднікаў у кожным поўным сканаванні былі фрагментаваны з дапамогай HCD з нармалізаванай энергіяй сутыкнення 30%, квадрупольным акном ізаляцыі 1,6 м/г і дазволам 30 000.Мішэнь АРУ для тандэмнай мас-спектраметрыі з выкарыстаннем 5×104 і максімальным часам уводу 150 мс.Дынамічнае выключэнне ўстаноўлена на 30 секунд. Неразмеркаваныя іёны або іёны з зарадам 1+ і >7+ былі адхілены для MS/MS. Неразмеркаваныя іёны або іёны з зарадам 1+ і >7+ былі адхілены для MS/MS. Неўказаныя іёны або іёны з зарадам 1+ і >7+ былі адхілены для МС/МС. Іёны без прызначэння або іёны з зарадам 1+ і >7+ былі адхілены для MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。. Неўказаныя іёны або іёны з зарадамі 1+ і >7+ былі адхілены для МС/МС. Неўказаныя іёны або іёны з зарадамі 1+ і >7+ былі адхілены для MS/MS.
Неапрацаваныя дадзеныя апрацоўваюцца з дапамогай вылічальнай платформы FragPipe на аснове MSFragger.Зрушэнні па масе і адпаведныя амінакіслоты былі вызначаны з выкарыстаннем алгарытму адкрытага пошуку з допускам па масе папярэдніка ад -150 да 500 Да.Затым мадыфікаваныя пептыды ідэнтыфікавалі з выкарыстаннем мадыфікацый гістыдыну з прыростам масы +229,0964 і +247,1069 Да ў PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Клеткі, якія стабільна экспрессируют зліты ген miniSOG, высаджвалі ў 6-сантыметровыя чашкі.Пасля дасягнення ~80% зліцця клеткі адзін раз прамывалі HBSS (Gibco, #14025092), затым інкубавалі з хімічнымі зондамі ў HBSS на працягу 1 гадзіны пры 37 °C і асвятлялі сінім святлом.Святлодыёд 10 Вт на працягу 20 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Каб вызначыць, які тып актыўных формаў кіслароду ўдзельнічае ў PDPL, 0,5 ммоль вітаміна C (MCE, #HY-B0166), 5 ммоль Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 мМ маніту (Energy Chemical, #69-65-8), 100 мкМ H2O2, 10 мМ NaN3 былі дададзены ў клеткі ў якасці дадатку.Пасля прамывання халодным PBS клеткі саскрабалі, збіралі ў цэнтрыфужныя прабіркі на 1,5 мл і апрацоўвалі ультрагукам з наканечнікам на працягу 1 хвіліны ў 200 мкл PBS з 1x інгібітарам протеазы без ЭДТА (1 с і 1 с без, амплітуда 35%).Атрыманую сумесь центрифугировали пры 15871 × g на працягу 10 хвілін пры 4 °C і канцэнтрацыю супернатанта давялі да 1 мг/мл з дапамогай набору для аналізу бялку BCA.Прыблізна 50 мкл вышэйпаказанага лізата інкубавалі з 0,1 ммоль родаміназіду (Aladdin, № T131368), 1 ммоль TCEP, 0,1 ммоль ліганду TBTA і 1 ммоль CuSO4 на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы з кручэннем знізу ўверх.Пасля рэакцыі пстрычкі праводзілі асаджэнне ацэтонам шляхам дадання 250 мкл папярэдне астуджанага ацэтону да ўзораў, інкубацыі пры -20°C на працягу 20 хвілін і цэнтрыфугавання пры 6010×g на працягу 10 хвілін пры 4°C.Збярыце асадак і кіпяціце ў 50 мкл 1x буфера Лэммлі на працягу 10 хвілін пры 95 °C.Затым узоры аналізавалі на доўгіх гелях SDS-PAGE і візуалізавалі з дапамогай сістэмы візуалізацыі Bio-rad ChemiDoc MP Touch з праграмным забеспячэннем Image Lab Touch.
Экспрэсію і ачыстку рэкамбінантнага бялку miniSOG-6xHis праводзілі, як апісана раней.Коратка, клеткі E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) трансфармавалі pET21a-miniSOG-6xHis, а экспрэсію бялку індукавалі 0,5 мМ IPTG (Sangon, #A600168).Пасля лізісу клетак вавёркі ачышчалі з дапамогай Ni-NTA агарозных шарыкаў (MCE, № 70666), дыялізавалі супраць PBS і захоўвалі пры -80°C.
Для аналізу блізкасці меткі на аснове антыцелаў in vitro змяшайце 100 мкМ вычышчанага miniSOG, 1 мМ зонда 3 і 1 мкг моноклональных мышыных антыцелаў супраць меткі (TransGen, #HT501-01) у PBS да агульнага рэакцыйнага аб'ёму 50 мкл..Рэакцыйную сумесь апраменьвалі сінім святлодыёдам на працягу 0, 2, 5, 10 і 20 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Сумесь інкубавалі з 0,1 ммоль біятын-ПЭГ3-азіду (Aladdin, #B122225), 1 ммоль TCEP, 0,1 ммоль TBTA-ліганда і 1 ммоль CuSO4 на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы на качалцы з рухам уверх.Пасля імгненнай рэакцыі дадайце 4x буфер Лэммлі непасрэдна ў сумесь і кіпяціце пры 95°C на працягу 10 хвілін.Узоры аналізавалі на гелях SDS-PAGE і вестэрн-блоттингом са стрэптавідынам-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Сінтэтычны пептыд, які змяшчае гістыдын, з С-канцавым амідаваннем (LHDALDAK-CONH2) выкарыстоўваўся для аналізу маркіроўкі in vitro на аснове пептыдаў.У гэтым аналізе 100 мкМ вычышчанага miniSOG, 10 мМ зонда 3 і 2 мкг/мл сінтэтычнага пептыда змешвалі ў PBS у агульным рэакцыйным аб'ёме 50 мкл.Рэакцыйную сумесь апраменьвалі сінім святлодыёдам на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы.Адзін мікралітр узору быў прааналізаваны з дапамогай сістэмы LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight мас-спектрометр з праграмным забеспячэннем аналізу спектру MassLynx).
Клеткі HEK293T, стабільна экспрессирующие зліты ген miniSOG, высейвалі ў 10-сантыметровыя чашкі для ліній з рознай лакалізацыяй арганэл (Mito, ER, Nucleus) і 15-сантыметровыя чашкі для ліній Parkin-miniSOG і BRD4-miniSOG.Пасля дасягнення ~90% зліцця клеткі адзін раз прамывалі HBSS, затым інкубавалі з зондам 3 у HBSS на працягу 1 гадзіны пры 37°C і асвятлялі сінім святлодыёдам 10 Вт пры пакаёвай тэмпературы.Для бескантактавага маркіроўкі Parkin дабаўлялі 10 мкМ пратоннага карбанілацыяніднага носьбіта м-хлорфенілгідразону CCCP (Solarbio, #C6700) з зондам 3 у HBSS на 1 гадзіну пры 37°C.Стадыі лізісу клетак, хіміі пстрычкі, аднаўлення і алкілавання былі такімі ж, як апісаны вышэй, за выключэннем таго, што дадавалі 2 мг лізата і ў рэакцыі пстрычкі выкарыстоўвалі азід біятыну PEG3 замест азіду біятыну, які паддаецца фотараскладанню.Пасля ўзбагачэння шарыкі прамывалі 3 разы 5 мл PBS, які змяшчае 0,2% SDS, 3 разы 5 мл PBS, які змяшчае 1 М мачавіну, і 3 разы 5 мл PBS.Пасля гэтага да 300 мкл 25 мМ раствора ABC, які змяшчае 1 М мачавіны, дадаюць 2 мкг трыпсінаў для расшчаплення бялку на працягу ночы пры 37°C.Рэакцыю спынялі даданнем мурашынай кіслаты да дасягнення рн 2-3.Пасля трыпсінізацыі шарыкаў раствор пептыда абяссольвалі з дапамогай калонкі SOLAµ HRP (Thermo, № 60209-001) і сушылі ў вакуумным канцэнтратары Speedvac.Пептыды зноў растваралі ў 0,1% мурашынай кіслаты і 500 нг пептыдаў аналізавалі з дапамогай мас-спектрометра Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, абсталяванага крыніцай нана-ESI, апісанай вышэй.Пептыды падзялялі на камерцыйных папярэдніх калонках RP-HPLC (75 мкм х 2 см) (Thermo, № 164946) і аналітычных калонках RP-HPLC (75 мкм х 25 см) (Thermo, № 164941), абедзве запоўненыя 2 мкм.градыент ад 8% да 35% ACN за 60 хвілін, затым лінейна павялічваецца да 98% B за 6 хвілін пры хуткасці патоку 300 Нл/мін.Спектры МС (350-1500 m/z) збіраліся з дазволам 60 000, AGC 4 × 105 і максімальным часам уводу 50 мс.Выбраныя іёны былі паслядоўна фрагментаваны з дапамогай HCD у 3-секундных цыклах з нармалізаванай энергіяй сутыкнення 30%, квадрупольным ізаляцыйным акном 1,6 m/z і раздзяленнем 15000. Тандэмная мішэнь AGC мас-спектрометра 5 × 104 і максімальны час увядзення 22 мс.Дынамічнае выключэнне ўстаноўлена на 45 секунд. Неразмеркаваныя іёны або іёны з зарадам 1+ і >7+ былі адхілены для MS/MS. Неразмеркаваныя іёны або іёны з зарадам 1+ і >7+ былі адхілены для MS/MS. Неўказаныя іёны або іёны з зарадам 1+ і >7+ былі адхілены для МС/МС. Іёны без прызначэння або іёны з зарадам 1+ і >7+ былі адхілены для MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。. Неўказаныя іёны або іёны з зарадамі 1+ і >7+ былі адхілены для МС/МС. Неўказаныя іёны або іёны з зарадамі 1+ і >7+ былі адхілены для MS/MS.
Этапы падрыхтоўкі ўзораў да ўзбагачэння шарыкаў нейтравідыну былі такімі ж, як і ў аналізе ВХ-МС/МС, апісаным вышэй.Прыкладна 50 мкг лізата выкарыстоўвалі ў якасці ўводу для кантролю загрузкі, а 2 мг лізата выкарыстоўвалі для рэакцыі пстрычкі.Пасля ўзбагачэння і прамывання нейтравідынам звязаныя вавёркі элюіравалі шляхам дадання 50 мкл буфера Лэммлі да шарыкаў смалы агарозы і кіпячэння пры 95°C на працягу 5 хвілін.Увод кантрольнай нагрузкі і узбагачаныя шарыкамі ўзоры былі прааналізаваны з дапамогай SDS-PAGE і перанесены на мембраны PVDF (Millipore, #ISEQ00010) стандартнымі метадамі Вестэрн-блот.Мембраны блакавалі 5% абястлушчаным малаком (Sangon, #A600669) у TBS, які змяшчае 0,1% Твін-20 (TBST), і інкубавалі паслядоўна з першаснымі і другаснымі антыцеламі.Першасныя антыцелы разводзілі 1:1000 у 5% абястлушчаным малацэ ў TBST і інкубавалі на працягу ночы пры 4°C.Другасныя антыцелы выкарыстоўвалі ў суадносінах 1:5000 і інкубавалі 1 гадзіну пры пакаёвай тэмпературы.Мембраны візуалізавалі з дапамогай хемілюмінесцэнцыі з дапамогай сістэмы візуалізацыі Chemidoc MP.Усе неразрэзаныя сканы клякс і геляў на малюнку прадстаўлены як зыходныя даныя.
Асноўныя антыцелы, выкарыстаныя ў гэтым даследаванні, уключалі трусіныя моноклональные антыцелы супраць SFPQ (CST, № 71992), трусіныя моноклональные антыцелы супраць FUS (CST, № 67840), поліклональныя антыцелы труса супраць NSUN2 (Proteintech, № 20854-1- AP), поліклональныя антыцелы труса супраць mSin3A (Abcam, #ab3479), моноклональные антыцелы мышы супраць меткі (TransGen, #HT201-02), моноклональные антыцелы мышы супраць β-актыну (TransGen, #HC201-01), антыцелы труса -CDK2 моноклональные антыцелы (ABclonal, #A0094), трусіныя моноклональные антыцелы да CTBP1 (ABclonal, #A11600), трусіныя поліклональные антыцелы да DUT (ABclonal, #A2901), трусіныя поліклональные антыцелы да PSMC4 (ABclonal, #A2505), трусіныя антыцелы Поліклональныя антыцелы DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Гэтыя антыцелы выкарыстоўвалі ў развядзенні 1:1000 у 5% абястлушчаным малацэ ў TBST.Другасныя антыцелы, якія выкарыстоўваліся ў гэтым даследаванні, уключалі антыцелы супраць труса (TransGen, #HS101-01), антыцелы супраць IgG мышы (TransGen, #HS201-01) у развядзенні 1:5000.
Для далейшага вывучэння таго, ці ўзаемадзейнічае BRD4 з SFPQ, стабільныя клеткі HEK293T і BRD4-miniSOG з празмернай экспрэсіяй HEK293T былі высаджаны ў 10-сантыметровыя чашкі.Клеткі прамывалі халодным PBS і лізіравалі ў 1 мл буфера для лізісу Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) з інгібітарам пратэазы без ЭДТА на працягу 30 хвілін пры 4°C.Пасля гэтага лізаты збіралі ў центрифужные прабіркі аб'ёмам 1,5 мл і центрифугировали пры 15871 х g на працягу 10 хвілін пры 4 ° С.Супернатант збіралі і інкубавалі з 5 мкг мышыных моноклональных антыцелаў, пазначаных анты-V5 (CST, #80076) на працягу ночы пры 4°C.Прамыйце прыкладна 50 мкл магнітных шарыкаў бялку A/G (MCE, #HY-K0202) двойчы PBS, які змяшчае 0,5% Tween-20.Затым клеткавыя лізаты інкубавалі з магнітнымі шарыкамі на працягу 4 гадзін пры 4 ° C з кручэннем знізу ўверх.Затым шарыкі прамывалі чатыры разы 1 мл буфера PBST і кіпяцілі пры 95 ° C на працягу 5 мін.Узоры аналізавалі на гелі SDS-PAGE і пераносілі на мембраны PVDF з выкарыстаннем стандартных метадаў Вестэрн-блот.Мембраны блакавалі ў 5% абястлушчаным малацэ ў TBST і інкубавалі паслядоўна з першаснымі і другаснымі антыцеламі.Першасныя антыцелы Трусіныя моноклональные антыцелы супраць SFPQ (CST, №71992) выкарыстоўвалі ў суадносінах 1:1000 у 5% абястлушчаным малацэ ў TBST і інкубавалі на працягу ночы пры 4°C.Антытрусіны IgG выкарыстоўвалі ў суадносінах 1:5000 і інкубавалі на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы.Мембраны візуалізавалі з дапамогай хемілюмінесцэнцыі з дапамогай сістэмы візуалізацыі Chemidoc MP.
Усе структуры, якія выкарыстоўваліся для аналізу плошчы паверхні, даступнай для растваральніка (SASA), былі атрыманы з банка даных бялку (PDB)52 або базы дадзеных структуры бялку AlphaFold53.Абсалютны SASA быў разлічаны для кожнага астатку з дапамогай праграмы FreeSASA.Толькі поўныя і адназначныя дадзеныя SASA для пазначанага гістідіна і яго суседзяў выкарыстоўваліся для атрымання сярэдняга SASA для кожнай структуры.Адносная даступнасць растваральніка (RSA) для кожнага гістідіна была разлічана шляхам дзялення абсалютнага значэння SASA на эмпірычную максімальна магчымую плошчу паверхні рэшткаў, даступную для растваральніка.Затым усе гістыдыны класіфікаваліся як схаваныя, калі сярэдняе RSA было ніжэй за 20%, у адваротным выпадку падвяргаліся ўздзеянню56.
Неапрацаваныя файлы, атрыманыя ў рэжыме DDA, шукалі з дапамогай Proteome Discoverer (v2.5) або MSfragger (Fragpipe v15.0) у адпаведнай праверанай SwissProt базе дадзеных бялку, якая змяшчае агульныя забруджвальнікі.Пептыды патрабавалі поўнага трыпсінаў з двума адсутнымі ўчасткамі расшчаплення, метыляваннем карбамоіла ў якасці фіксаванай мадыфікацыі і акісленнем метыёніна ў якасці дынамічнай мадыфікацыі.Дапушчальныя адхіленні вагі папярэдніка і фрагмента былі ўстаноўлены на 10 частак на мільён і 0,02 Да (MS2 Orbitrap) адпаведна. Забруджвальныя хіты былі выдалены, і вавёркі былі адфільтраваны, каб атрымаць частату ілжывых адкрыццяў <1%. Забруджвальныя хіты былі выдалены, і вавёркі былі адфільтраваны, каб атрымаць частату ілжывых адкрыццяў <1%. Пападання загрязняющих рэчываў былі выдалены, а белкі адфільтраваны, каб атрымаць каэфіцыент ложнага выяўлення <1%. Трапленні забруджванняў выдалялі, а вавёркі фільтравалі, каб атрымаць частату ілжывага выяўлення <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。. <1%的错误发现率. Пападання загрязняющих рэчываў былі выдалены, а белкі адфільтраваны для дасягнення ўзроўню ложных выяўленых <1%. Трапленні забруджвальных рэчываў выдалялі, а вавёркі фільтравалі для дасягнення частаты ілжывых станоўчых дадаткаў <1%.Для колькаснага аналізу без выкарыстання метак выкарыстоўвалася нармалізаванае ўтрыманне бялку з трох біялагічных паўтораў.Аналіз субклеткавай лакалізацыі бялку быў выкананы з дапамогай аналізу геннай анталогіі (GO) з DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 і баз дадзеных, сабраных і апублікаваных групай Alice Ting.Карта вулкана была атрымана з Персея (v1.6.15.0). Змены колькасці бялку ў разы былі правераны на статыстычную значнасць з дапамогай двухбаковага t-крытэрыю, і хіты бялку былі ідэнтыфікаваныя са змяненнем колькасці >2 (калі не пазначана іншае) і значэннем p <0,05. Змены колькасці бялку ў разы былі правераны на статыстычную значнасць з дапамогай двухбаковага t-крытэрыю, і хіты бялку былі ідэнтыфікаваныя са змяненнем колькасці >2 (калі не пазначана іншае) і значэннем p <0,05. Змены кратнасці ўтрымання белка былі пацверджаны на статыстычную значнасць з выкарыстаннем двухбаковага t-крытэрыю, а супадзення белкаў былі ідэнтыфікаваныя пры змене ўтрымання> 2 (калі не паказана іное) і значэннем p <0,05. Змены ўтрымання бялку былі правераны на статыстычную значнасць з дапамогай двухбаковага t-крытэрыю, і супадзенне бялку вызначалася са змяненнем утрымання >2 (калі не пазначана іншае) і значэннем р <0,05.使用 双边 t 检验 测试 丰度 丰度 倍数 变化 的 统计 统计 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 和 p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 倍 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 并 确定 蛋白质 命 中 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 P 值 <0,05。 Статыстычная значнасць кароткіх змяненняў утрымання белка правяралася з выкарыстаннем двухбаковага t-крытэрыю, а супадзенні белкаў вызначаліся для змяненняў утрымання > 2 (калі не паказана іное) і p-значэнне <0,05. Статыстычная значнасць кратных змяненняў утрымання бялку была праверана з дапамогай двухбаковага t-крытэрыю, і супадзенне бялкоў вызначалася для змяненняў утрымання >2 (калі не пазначана іншае) і р-значэнняў <0,05.Аналіз узаемадзеяння бялкоў праводзіўся з дапамогай аналізу GO разам з базай дадзеных String.
Тры біялагічныя паўторы былі праведзены з аналагічнымі вынікамі.Статыстычны аналіз быў праведзены з дапамогай GraphPad Prism (праграмнае забеспячэнне GraphPad), а графікі вулканаў былі створаны з дапамогай Perseus (v1.6.15.0).Каб параўнаць дзве групы, р-значэнні былі вызначаны з дапамогай двухбаковага t-крытэрыю Ст'юдэнта.Толькі вавёркі-адзіночкі, ідэнтыфікаваныя як мінімум двойчы ў эксперыментальнай групе, былі ўключаны ў графікі вулкана, а адпаведныя адсутныя значэнні ў кантрольнай групе былі заменены на Perseus з нармальнага размеркавання, каб можна было вылічыць р-значэнне.Слупкі памылак прадстаўляюць сярэдняе ± стандартнае адхіленне.У пратэёмных аналізах для статыстычнага аналізу захавалася колькасць бялкоў, якія з'явіліся як мінімум у двух біялагічных паўторах.Для папярэдняга вызначэння памеру выбаркі статыстычныя метады не выкарыстоўваліся.Эксперыменты не выпадковыя.Падчас эксперыменту і ацэнкі вынікаў даследчыкі не закрывалі вочы на задачы.
Для атрымання дадатковай інфармацыі аб дызайне даследавання глядзіце анатацыю да справаздачы аб даследаваннях прыроды, спасылка на якую спасылаецца на гэты артыкул.
Дадзеныя мас-спектраметрыі, атрыманыя ў гэтым даследаванні, былі прадстаўлены ў кансорцыум ProteomeXchange праз партнёрскі рэпазітар iProX57 пад ідэнтыфікатарам набору даных PXD034811 (набор даных PDPL-MS).Неапрацаваныя даныя прадастаўляюцца ў выглядзе файлаў неапрацаваных даных.У гэтым артыкуле прадстаўлены зыходныя дадзеныя.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Знаёмства з наваколлем: выкарыстанне залежнага ад блізкасці біятынілявання для характарыстыкі бялковых комплексаў і карты арганэл. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Знаёмства з наваколлем: выкарыстанне залежнага ад блізкасці біятынілявання для характарыстыкі бялковых комплексаў і карты арганэл.Gingras, AS, Abe, KT і Raut, B. Знаёмства з асяроддзем: выкарыстанне залежнага ад блізкасці биотинилирования для характарыстыкі бялковых комплексаў і карты арганэл. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘制细胞器图。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Разуменне наваколля: выкарыстоўвайце залежнасць наваколля ад біялагічнага жыцця.Gingras, AS, Abe, KT і Raut, B. Разуменне блізкасці: характарыстыка бялковых комплексаў і адлюстраванне арганэл з выкарыстаннем залежнага ад блізкасці биотинилирования.Ток.Маё меркаванне.Хімічны.біялогія 48, 44–54 (2019).
Geri, JB і інш.Карціраванне мікраасяроддзя шляхам перадачы энергіі Дэкстэра імунным клеткам.Навука 367, 1091–1097 (2020).
Хертлінг Э. Л. і інш.Двухпратэомныя маштабныя сеткі выяўляюць клеткава-спецыфічнае перабудова чалавечага інтэрактома.Клеткі 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Час публікацыі: 15 верасня 2022 г
