Навіны

Дзякуй за наведванне Nature.com.Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS.Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer).Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем візуалізаваць сайт без стыляў і JavaScript.
Ракавыя клеткі выпрацавалі розныя механізмы для пераадолення клеткавага стрэсу і далейшага прагрэсавання.Пратэінкіназа R (PKR) і яе бялковы актыватар (PACT) з'яўляюцца першапачатковымі адказчыкамі, якія кантралююць розныя сігналы стрэсу, што прыводзіць да інгібіравання праліферацыі клетак і апоптозу.Аднак рэгуляцыя шляху PACT-PKR у ракавых клетках застаецца ў значнай ступені невядомай.Тут мы выявілі, што доўгая некадуючая РНК (lncRNA) аспартыл-тРНК-сінтэтаза, антысэнсавая РНК-1 (DARS-AS1) непасрэдна ўдзельнічае ў інгібіраванні шляху PACT-PKR і спрыяе праліферацыі ракавых клетак.Выкарыстоўваючы буйнамаштабны функцыянальны скрынінг lncRNA CRISPRi 971, звязаны з ракам, мы выявілі, што DARS-AS1 быў звязаны са значна ўзмацненнем праліферацыі ракавых клетак.Такім чынам, накаўт DARS-AS1 інгібіруе праліферацыю клетак і спрыяе апоптозу ракавых клетак у розных лініях ракавых клетак in vitro і значна зніжае рост пухліны in vivo.Механічна DARS-AS1 звязваецца непасрэдна з даменам актывацыі PACT і прадухіляе ўзаемадзеянне PACT-PKR, тым самым памяншаючы актывацыю PKR, фасфараляванне eIF2α і інгібіруючы апоптозную гібель клетак.Клінічна DARS-AS1 шырока выяўляецца пры некалькіх відах раку, і празмерная экспрэсія гэтай lncRNA сведчыць аб дрэнным прагнозе.Гэта даследаванне высвятляе спецыфічную для рака рэгуляцыю шляху PACT-PKR з дапамогай DARS-AS1 lncRNA і дае яшчэ адну мішэнь для прагназавання і лячэння рака.
Здольнасць адаптавацца да стрэсу з'яўляецца важнай характарыстыкай выжывання і праліферацыі ракавых клетак.Хуткая праліферацыя і метабалічныя характэрныя рысы раку дасягаюць піку ў суровых мікраасяроддзях - дэфіцыт пажыўных рэчываў, гіпаксія і нізкі pH - якія могуць выклікаць сігнальныя шляхі гібелі клетак.Парушэнне рэгуляцыі адчувальных да стрэсу генаў, такіх як p535, бялкі цеплавога шоку 6, 7, KRAS8, 9 і HIF-110, 11, 12, 13, часта назіраецца пры раку, тым самым блакуючы апоптоз і спрыяючы выжыванню.
Пратэінкіназа R (PKR) з'яўляецца важным датчыкам стрэсу і субадзінак кіназы эукарыятычнага фактару ініцыяцыі 2α (eIF2α), трансляцыйнага рэгулятара, які звязвае клеткавы стрэс са смерцю клетак.Першапачаткова PKR быў ідэнтыфікаваны як супрацьвірусны бялок шляхам выяўлення чужароднай двухцепочечной РНК (dsRNA).Пасля актывацыі PKR фасфарылюе eIF2α для інгібіравання сінтэзу віруснага і клеткавага бялку14,15,16.PACT (бялок-актыватар PKR) быў ідэнтыфікаваны як першы бялок-актыватар PKR у адсутнасць dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Праз прамое ўзаемадзеянне з PKR PACT трансдуцыруе розныя стрэсы (сыроватачнае галаданне, апрацоўка перакісам або арсенітам) на PKR і далейшыя сігнальныя шляхі.У дадатак да фасфаралявання eIF2α, апасродкаваная PACT актывацыя PKR выклікае розныя падзеі, звязаныя з рэакцыяй на стрэс, у тым ліку змяненне акісляльна-аднаўленчага статусу праз шлях PI3K/Akt24, узмоцненую праверку пашкоджанняў ДНК праз p5325,26 і NF-κB27,28 Рэгулюе транскрыпцыю, 29. Улічваючы іх важную ролю ў адказе на стрэс, праліферацыі, апоптозе і іншых ключавых клеткавых працэсах, PKR і PACT з'яўляюцца перспектыўнымі тэрапеўтычнымі мішэнямі для многіх захворванняў, асабліва рака 30,31,32,33.Аднак, нягледзячы на ​​гэтае плейотропное функцыянальнае і біялагічнае значэнне, рэгуляцыя актыўнасці PACT/PKR ў ракавых клетках застаецца няўлоўнай.
lncRNA - гэта стэнаграмы памерам больш за 200 нуклеатыдаў без патэнцыялу кадавання бялку.З таго часу, як перадавыя праекты секвеніравання цэлага геному выявілі тысячы lncRNA35,36, было зроблена шмат намаганняў для высвятлення іх біялагічных функцый.Усё большая колькасць даследаванняў паказвае, што lncRNAs удзельнічаюць у многіх біялагічных працэсах37, уключаючы рэгуляцыю інактывацыі Х-храмасомы38,39, імпрынтынг40, транскрыпцыю41,42, трансляцыю43 і нават рост рака44,45,46,47.Гэтыя даследаванні паказалі, што многія lncRNA ўдзельнічаюць у шляху PACT/PKR.Адно з такіх даследаванняў паказала, што lncRNA ASPACT інгібіравала транскрыпцыю PACT і павялічвала ядзерную затрымку мРНК PACT.Іншыя даследаванні паказалі, што lncRNA nc886 звязваецца з PKR і інгібіруе яго фасфараляванне49,50.Да гэтага часу не паведамлялася пра lncRNA, якая рэгулюе PACT-апасродкаваную актывацыю PKR.
Антысэнсавая РНК 1 аспартыл-тРНК-сінтэтазы (DARS-AS1) была ідэнтыфікавана як анкагенная lncRNA51,52,53,54.Дзякуючы рэгуляцыі miP-194-5p53, miP-12952 і miP-532-3p51 было паказана, што DARS-AS1 спрыяе росту светлаклеткавага нырачна-клеткавага рака, шчытападобнай залозы і немелкоклеточного рака лёгкага адпаведна.Тонг і яго калегі таксама выявілі, што DARS-AS1 спрыяе прагрэсаванню міеломы, падтрымліваючы стабільнасць матыву, які звязвае РНК бялку 39 (RBM39).Аднак не было праведзена даследаванняў, ці ўдзельнічае гэтая lncRNA у рэгуляцыі актывацыі PACT-PKR і стрэсавай рэакцыі ракавых клетак.
Тут мы правялі шырокамаштабнае даследаванне страты функцыі з дапамогай сістэмы CRISPRi і вызначылі, што lncRNA DARS-AS1 спрыяе праліферацыі некалькіх тыпаў ракавых клетак.Акрамя таго, мы вызначылі асноўны механізм: DARS-AS1 звязваецца непасрэдна з PACT, інгібіруе звязванне PACT і PKR, прадухіляе фасфараляванне eIF2α, ніжэйшага субстрата PKR, і ў канчатковым выніку інгібіруе апоптозную гібель клетак.У заключэнне наша праца раскрывае DARS-AS1 lncRNA як рэгулятар шляху PACT-PKR і патэнцыйную мішэнь для лячэння рака і прагнозу.
Шырокія даследаванні геномнага прафілявання выявілі сотні lncRNA, звязаных з ракам.Аднак іх функцыя застаецца ў значнай ступені невядомай56.Для ідэнтыфікацыі перспектыўных кандыдатаў lncRNA, якія ўдзельнічаюць у прагрэсаванні рака, мы правялі скрынінг страты функцыі для зніжэння праліферацыі ў клеткавай лініі колоректального рака SW620 з дапамогай сістэмы CRISPRi (мал. 1а).Унікальная асаблівасць клеткавых ліній рака тоўстай кішкі SW480 і SW620 заключаецца ў тым, што яны атрыманы з першасных і другасных пухлін аднаго пацыента.Гэта дае каштоўнае параўнанне для вывучэння генетычных змяненняў у прагрэсаванні запушчанага рака тоўстай кішкі.Такім чынам, мы прааналізавалі транскриптомы клеткавых ліній колоректального рака (SW480 і SW620) з дапамогай секвенирования РНК і сабралі некаторыя патэнцыйныя функцыянальныя lncRNA з апублікаванай літаратуры.Грунтуючыся на гэтых выніках, мы распрацавалі аб'яднаную бібліятэку sgRNA, якая змяшчае 7355 олигонуклеотидов sgRNA, нацэленых на 971 lncRNAs, звязаных з ракам, і 500 ненацэленых олигонуклеотидов sgRNA для адмоўнага кантролю (дадатковыя дадзеныя 1).
Схематычнае адлюстраванне скрынінга з дапамогай сістэмы CRISPRi.b ўзбагачэнне sgRNA пасля скрынінга.Гарызантальная пункцірная лінія ўяўляе log2 (змена кратнасці) = ±0,58.Вертыкальная пункцірная лінія паказвае значэнне p = 0,05.Чорныя кропкі ўяўляюць сабой нецэлевую sgRNA (пазначаную як NC).Чырвоныя кропкі - гэта sgRNA, накіраваныя на DARS-AS1.Сінія кропкі - гэта sgRNA, накіраваныя на LINC00205, раней апісаную анкагенную lncRNA.змяненне кратнасці = (нармаванае паказанне, дзень 17)/(нармаванае паказанне, дзень 0).c Накдаўн sgRNA DARS-AS1 інгібіраваў рост клетак.Слупкі памылак паказваюць ± стандартнае адхіленне трох эксперыментаў.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 двухбаковы t-крытэр Сцьюдэнта.d Экспрэсія DARS-AS1 у пухлінах (набор даных TCGA).em Экспрэсія DARS-AS1 у парных узорах нормы і пухліны ад пацыентаў з BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP і COAD адпаведна (набор даных TCGA).p-значэнні былі атрыманы з дапамогай парнага двухбаковага t-крытэрыю Ст'юдэнта.
Пасля канструявання плазміды і ўпакоўкі лентивируса мы трансдуцыравалі клетачную лінію рака прамой кішкі dCas9-SW620 з вышэйзгаданай бібліятэкай у чатырох незалежных эксперыментах па заражэнні.Множнасць заражэння (MOI) для гэтых інфекцый была 0,1-0,3, што паказвае на тое, што кожная клетка можа быць трансфікавана толькі адной sgRNA.Пасля 18 дзён культывавання in vitro профіль узбагачэння мэтавых sgRNA пасля скрынінга знізіўся або павялічыўся, у той час як колькасць нецэлевых кантрольных алігануклеатыдаў заставалася адносна нязменным у параўнанні з профілем перад скрынінгам, што паказвае на тое, што наша мэта мае высокую спецыфічнасць да экрана бібліятэка.Рыс.1б і дадатковая табліца 1). LINC00205, які, як паведамлялася раней, спрыяе прагрэсаванню рака лёгкіх і рака печані 58,59,60, быў адсеяны (log2 (кратнае змяненне) <-0,58, значэнне р <0,05), што пацвярджае надзейнасць гэтага скрынінга (мал. 1b). LINC00205, які, як паведамлялася раней, спрыяе прагрэсаванню рака лёгкіх і рака печані 58,59,60, быў адсеяны (log2 (кратнае змяненне) <-0,58, значэнне р <0,05), што пацвярджае надзейнасць гэтага скрынінга (мал. 1b). LINC00205, аб якім раней паведамлялася, што ён спрыяе прагрэсаванню рака лёгкіх і рака пячэння58, 59, 60, быў выключаны (log2 (кратнае змяненне) <-0,58, значэнне p <0,05), што пацвярджае надзейнасць гэтага скрынінга (рыс 1б). LINC00205, які, як паведамлялася раней, спрыяе прагрэсаванню рака лёгкага і рака печані 58,59,60, быў выключаны (log2 (кратнае змяненне) <-0,58, p-значэнне <0,05), што пацвярджае надзейнасць гэтага скрынінга (мал. 1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, аб якім раней паведамлялася, што ён дазваляе прагрэсаваць рак лёгкіх і выпечаных58, 59, 60, быў выключаны (log2 (кратнае змяненне) <-0,58, p-значэнне <0,05), што пацвярджае надзейнасць гэтага скрынінга (рыс 1б). LINC00205, які, як паведамлялася раней, спрыяе прагрэсаванню рака лёгкіх і печані 58,59,60, быў выключаны (log2 (кратнае змяненне) <-0,58, p-значэнне <0,05), што пацвярджае надзейнасць гэтага скрынінга (мал. 1b).
Сярод усіх правераных lncRNA таксама быў правераны DARS-AS1, прычым колькасць трох роднасных алігануклеатыдаў sgRNA значна зменшылася пасля 18 дзён культывавання, што сведчыць аб тым, што накдаўн гэтай lncRNA прывёў да зніжэння праліферацыі рака (мал. 1b).Гэты вынік быў дадаткова пацверджаны аналізам MTS у клетках рака прамой кішкі, які паказаў, што хуткасць росту накдаўн-клетак DARS-AS1 знізілася толькі ўдвая ў параўнанні з кантрольнымі клеткамі (малюнак 1c) і супадала з папярэднімі паведамленнямі пра некалькі іншых тыпаў раку.: светлаклетачны рак ныркі, рак шчытападобнай залозы і немелкоклеточный рак лёгкага 51,52,53,55.Аднак яго функцыя і малекулярныя механізмы пры колоректальном раку застаюцца нявывучанымі.Такім чынам, мы абралі гэтую lncRNA для далейшага вывучэння.
Каб вывучыць экспрэсію DARS-AS1 у пацыентаў, мы ўсебакова прааналізавалі 10 327 узораў пухлін з праекта Cancer Genome Atlas (TCGA).Нашы вынікі паказваюць, што DARS-AS1 шырока экспрэсіруецца і значна павышаецца ў здаровых клетках пры розных пухлінах, уключаючы аденокарциному тоўстай кішкі (COAD), светлоклеточный рак нырак (KIRC) і нырачны папиллярно-клеткавы рак (KIRP)..Вельмі мала (мал. 1d і дадатковы малюнак 1a, b). Аналіз парных узораў здаровых/пухлінных узораў дадаткова пацвердзіў значна больш высокую экспрэсію DARS-AS1 у пухлінах уротелиальной карцыномы мачавой бурбалкі (BLCA), светлаклеткавай карцыномы ныркі (KIRC), аденокарциномы прастаты (PRAD), плоскоклеточного рака лёгкіх (LUSC) , карцынома эндаметрыя цела маткі (UCEC), аденокарцинома лёгкага (LUAD), гепатоцеллюлярная карцынома печані (LIHC), нырачна-папіллярно-клеткавая карцынома (KIRP) і аденокарцинома тоўстай кішкі (COAD) (значэнне р <0,05) (мал. 1e-m) . Аналіз парных узораў здаровых/пухлінных узораў дадаткова пацвердзіў значна больш высокую экспрэсію DARS-AS1 у пухлінах уротелиальной карцыномы мачавой бурбалкі (BLCA), светлаклеткавай карцыномы ныркі (KIRC), аденокарциномы прастаты (PRAD), плоскоклеточного рака лёгкіх (LUSC) , карцынома эндаметрыя цела маткі (UCEC), аденокарцинома лёгкага (LUAD), гепатоцеллюлярная карцынома печані (LIHC), нырачна-папіллярно-клеткавая карцынома (KIRP) і аденокарцинома тоўстай кішкі (COAD) (значэнне р <0,05) (мал. 1e-m) .Аналіз парных здаровых/пухлінных узораў таксама пацвердзіў значна больш высокую экспрэсію DARS-AS1 у пухлінах уротелиальной карцыномы мачавой бурбалкі (BLCA), светлаклеткавай нырачнай і нырачна-клеткавай карцыномы (KIRC), адэнакарцыномы прастаты (PRAD), плоскоклеточного рака лёгкіх (LUSC)., карцынома эндаметрыя цела маткі (UCEC), аденокарцинома лёгкага (LUAD), гепатоцеллюлярная карцынома пячэння (LIHC), папиллярно-клеткавая карцынома вочкі (KIRP) і аденокарцинома тоўстай кішкі (COAD) (значэнне p <0,05) (рыс. 1e– м) . , карцынома эндаметрыя цела маткі (UCEC), аденокарцинома лёгкага (LUAD), гепатоцеллюлярную карцынома печані (LIHC), папіллярные клеткавы рак ныркі (KIRP) і аденокарцинома тоўстай кішкі (COAD) (значэнне р < 0,05) (мал. 1e–m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着 更 高. <0,05）(图1e-m）).配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Аналіз парных узораў здаровых/пухлінных у далейшым пацвердзіў ролю DARS-AS1 у пухлінах уротелиальной карцыномы мачавой бурбалкі (BLCA), светлаклеткавай нырачна-клеткавай карцыномы (KIRC), адэнакарцыномы прастаты (PRAD) і плоскоклеточного рака лёгкіх (LUSC).экспрэсія пры карцыноме цела маткі (UCEC), аденокарциноме лёгкага (LUAD), гепатоцеллюлярной карцыноме (LIHC), пачечно-чечечном папиллярно-клеткавым карцыноме (KIRP) і аденокарциноме тоўстай кішкі (COAD) (значэнне p <0,05) (рис. 1е). -м). экспрэсія ў карцыноме цела маткі (UCEC), аденокарциноме лёгкага (LUAD), гепатоцеллюлярной карцыноме (LIHC), нырачна-сосочкового раку (KIRP) і аденокарциноме тоўстай кішкі (COAD) (значэнне р <0,05) (малюнак 1e -m).У сукупнасці гэтыя вынікі паказваюць, што DARS-AS1 шырока і моцна экспрэсіўны ў розных відах раку.
Паколькі DARS-AS1 і DARS (ген, які кадуе антысэнсавы ланцуг) маюць адзін і той жа прамотар і размешчаны побач, мы распрацавалі shRNA спецыяльна для накдаўну DARS-AS1, але не DARS (дадатковы малюнак 2a,b і дадатковая табліца 2) .У дадатак да SW620 мы таксама выкарысталі тры іншыя клетачныя лініі з высокай экспрэсіяй DARS-AS1 для вывучэння эфектыўнасці і функцыі накдаўну shRNA (дадатковая табліца 3).Нашы вынікі паказалі, што ўсе тры распрацаваныя shRNA дасягнулі не менш за 80% эфектыўнасці накдаўну DARS-AS1 з невялікім уплывам на колькасць мРНК DARS (дадатковы малюнак 2c–f).Акрамя таго, мы выявілі, што накдаўн DARS-AS1 з дапамогай гэтых shRNA істотна інгібіраваў рост клетак у клеткавых лініях колоректального рака SW620 (49,7%) і HCT116 (27,7%), лініі клетак рака малочнай залозы MBA-MD-231 (53,4%).) і клетачнай лініі гепатомы HepG2 (зніжэнне на 92,7%), а таксама іх здольнасці ўтвараць незамацаваныя сферы (сярэдняе памяншэнне ~50,8%, 44,6%, 40,7% і 75,7% на лінію клетак) (мал. 2a,b).У SW620 вынікі аналізу фарміравання калоніі дадаткова пацвердзілі, што shRNA DARS-AS1 значна інгібіравала праліферацыю клетак з сярэднім зніжэннем прыблізна на 69,6% (мал. 2c).
Уплыў кантрольнай шРНК і шРНК DARS-AS1 на праліферацыі клетак (а) і адукацыю сфероідаў (б) у клетках SW620, HCT116, MBA-MD-231 і HepG2.c Уплыў кантрольнай shRNA і DARS-AS1 shRNA на адукацыю калоній у клетках SW620.Клеткавая праліферацыя (d), адукацыя сфероідаў (e) і адукацыя калоніі (f) клетак SW620, якія падвышана экспрэсуюць DARS-AS1.Паказаныя даныя з'яўляюцца сярэднім ± стандартным адхіленнем трох эксперыментаў.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 і *** p ≤ 0,001 па двухбаковым t-крытэрыі Ст'юдэнта.
Каб дапоўніць даследаванні страты функцыі, мы стварылі клеткі SW620, якія падвышана экспрэсуюць DARS-AS1 (дадатковы мал. 2g).Гіперэкспрэсія DARS-AS1 значна павялічыла рост клетак (у 1,8 разы), адукацыю незамацаваных сфероідаў (у 1,4 разы) і адукацыю калоній (у 3,3 разы) у клетках SW620 (мал. 2d-f).Мы пацвердзілі гэты вынік, выкарыстоўваючы іншую лінію клетак, якая экспрэсіруе DARS-AS1, A549.Гэтая ўзмоцненая праліферацыя клетак з-за залішняй экспрэсіі DARS-AS1 дадаткова назіралася ў клетках A549 (дадатковы малюнак 2h, i і дадатковая табліца 3).У сукупнасці гэтыя даследаванні прыросту і страты дэманструюць, што DARS-AS1 спрыяе праліферацыі ракавых клетак in vitro.
Каб вывучыць асноўны механізм, з дапамогай якога DARS-AS1 рэгулюе праліферацыю клетак, мы правялі аналіз РНК, каб выявіць яго патэнцыйных партнёраў па звязванні бялку.Вынікі RT-qPCR паказалі, што каля 86,2% DARS-AS1 знаходзіцца ў цытаплазме клетак SW620 (дадатковы малюнак 3a).Затым транскрыбаваны in vitro біятыніляваны DARS-AS1 або псеўдаРНК інкубавалі з лізатамі клетак SW620 з наступным аддзяленнем SDS-PAGE.Наступнае афарбоўванне срэбрам паказала, што выразная паласа (~38 кДа) была значна ўзбагачана ў DARS-AS1 цягнуць узораў, але не ва ўзорах фіктыўнай РНК або шарыкаў (мал. 3a).Гэтая паласа была ідэнтыфікавана як бялок, які актывуе PKR (PACT) з дапамогай мас-спектраметрыі (MS) і дадаткова пацверджана імунаблотынгам у клеткавых лініях SW620, HCT116 і HepG2 (мал. 3a,b).Ўзбагачэнне DARS і роднасных бялкоў PACT - PKR і TRBP - таксама даследавалі з дапамогай аналізу РНК метадам вестэрн-блоттинга (WB).Вынікі паказалі, што не было выяўлена прамога ўзаемадзеяння паміж РНК DARS-AS1 і гэтымі трыма вавёркамі (дадатковы малюнак 3b).Спецыфічнае ўзаемадзеянне паміж DARS-AS1 і PACT было дадаткова пацверджана аналізам імунапрэцыпітацыі РНК (RIP), які паказаў, што DARS-AS1 быў значна ўзбагачаны антыцеламі супраць PACT, але не іншымі кантрольнымі РНК (малюнак 3c).Каб вызначыць, ці ўзаемадзейнічае DARS-AS1 непасрэдна з PACT у адсутнасць якіх-небудзь іншых клеткавых кампанентаў, быў праведзены аналіз інтэрфераметрыі біяслою (BLI) in vitro з выкарыстаннем вычышчанага PACT.Пазначаную біятынам DARS-AS1 або фіктыўную РНК імабілізавалі на біясенсары стрэптавідыну (SA), а затым інкубавалі ў кінэтычным буферы, які змяшчае 1 мкМ PACT.Характэрна, што PACT моцна звязваўся з DARS-AS1 (значэнне KD ~26,9 нМ), але не імітаваў РНК (малюнак 3d).У сукупнасці гэтыя вынікі дэманструюць прамое ўзаемадзеянне і высокую блізкасць паміж DARS-AS1 і PACT.
Аналіз выцягвання РНК выявіў ўзаемадзеянне DARS-AS1 з PACT у клетках SW620.Вышэй, афарбоўванне срэбрам роднасных бялкоў.Ніжнія імунаблоты праводзілі з антыцеламі супраць PACT.b Аналіз падзення РНК быў праведзены ў клетках HCT116 (уверсе) і HepG2 (унізе).Узбагачэнне PACT было выяўлена з дапамогай иммуноблоттинга.Аналіз иммунопреципитации кРНК (RIP) праводзілі ў клетках SW620 з выкарыстаннем паказаных антыцелаў.d Крывыя звязвання PACT з поўнаметражным DARS-AS1 або кантрольнай РНК былі атрыманы з дапамогай біяслойнай інтэрфераметрыі (BLI).РНК была иммобилизована на биосенсоре стрэптавідыну.1 мкм PACT быў выкарыстаны для вымярэння асацыяцыі.Аналіз выцягвання РНК быў праведзены з выкарыстаннем біятыніляванага поўнаметражнага DARS-AS1 або ўсечанага (уверсе).Імунаблот, які паказвае атрыманы PACT (унізе).f Вычышчаны пазначаны PACT інкубавалі з біятыніляваным поўнаметражным DARS-AS1 або ўсечаным (як у e) для аналізу RIP in vitro.Выдзеленая РНК была праверана з дапамогай RT-qPCR.g Адноснае сродство розных фрагментаў РНК да PACT было атрымана з дапамогай біяслойнай інтэрфераметрыі.Для аналізу выкарыстоўвалі 100 нМ РНК і 1 мкМ RAST.h Аналізы RIP in vitro праводзілі з выкарыстаннем вычышчанага інтактнага або ўсечанага пазначанага PACT.Выдзеленая РНК была праверана з дапамогай RT-qPCR.i Хуткасць росту клетак SW620 з празмернай экспрэсіяй DARS-AS1, PACT або абодвух.j Залішняя экспрэсія поўнаметражнага або ўсечанага DARS-AS1 у клетках SW620 па-рознаму ўплывала на рост клетак.k Апоптоз быў выяўлены з дапамогай імунаблотынгу з антыцеламі супраць PARP.l Накаўт DARS-AS1 выклікае апоптоз клетак SW620, як паказала праточная цытаметрыя.Паказаныя даныя з'яўляюцца сярэднім ± стандартным адхіленнем трох эксперыментаў. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, па двухбаковым крытэрыі Ст'юдэнта. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, па двухбаковым крытэрыі Ст'юдэнта. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 па двухбаковым крытэрыю Сцюдэнта. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 па двухбаковым t-крытэрыі Ст'юдэнта. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 па двухбаковым крытэрыю Сцюдэнта. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 па двухбаковым t-крытэрыі Ст'юдэнта.
Затым мы стварылі тры біятыніляваных фрагмента РНК DARS-AS1 з дапамогай транскрыпцыі in vitro, каб вызначыць вобласць DARS-AS1, неабходную для асацыяцыі PACT (малюнак 3e).Вынікі аналізу РНК паказалі, што кожны фрагмент здольны ўзаемадзейнічаць з PACT, але 3'-канцавая вобласць (384-768 нуклеатыдаў, пазначаных A3) паказала больш за 1-384 нуклеатыдаў, пазначаных A1) (мал. 3e).Падобныя вынікі назіраліся ў аналізе RIP in vitro з выкарыстаннем рэкамбінантнага PACT (малюнак 3f).У адпаведнасці з гэтымі вынікамі эксперыменты па звязванні імабілізаваных фрагментаў РНК з PACT з выкарыстаннем BLI таксама паказалі, што PACT мае больш высокае сродство да A3 (384–768 нт) (значэнне KD прыкладна 94,6 нМ), у той час як сувязі з іншымі абласцямі амаль адсутнічаюць.(Мал. 3г).
Мы таксама вывучылі звязаныя вобласці звязвання ў PACT.PACT змяшчае тры функцыянальныя дамены, два з якіх з'яўляюцца кансерватыўнымі двухцепочечными РНК-звязваюць даменамі (dsRBD) і трэці дамен (пазначаны D3), які дзейнічае як актыватар бялковых узаемадзеянняў.Каб праверыць здольнасць звязвання lncRNA кожнага дамена, мы сканструявалі тры мутацыі, якія выдалілі кожны з трох даменаў, і правялі RIP-аналіз in vitro.Нашы вынікі паказалі, што выдаленне трэцяга дамена (D3) PACT значна зніжае яго ўзаемадзеянне з DARS-AS1 (у 0,11 раза ў параўнанні з непашкоджаным PACT) у параўнанні з двума іншымі мутацыямі (мал. 3h), было паказана, што вызваленне D3 ўзаемадзейнічаў з DARS.-AC1.У сукупнасці гэтыя вынікі паказваюць, што ўзаемадзеянне паміж DARS-AS1 і PACT можа адбывацца галоўным чынам праз 3'-канец DARS-AS1 і дамен D3 PACT.
Мы адзначылі, што DARS-AS1 не ўплываў на экспрэсію PACT, а PACT не ўплываў на DARS-AS1 (дадатковы мал. 3c).Затым мы вывучылі ўплыў накдаўну PACT на рост клетак.У адрозненне ад DARS-AS1, адносныя клеткі раслі ў 1,5-3 разы хутчэй, калі PACT быў збіты (дадатковы малюнак 3d).Вынікі аналізу адукацыі калоній паказалі, што клеткі ўтварылі 2-3-кратныя калоніі пасля апрацоўкі shRNA PACT (дадатковы малюнак 3e).Каб праверыць, ці рэгулюе DARS-AS1 праліферацыю клетак праз PACT, мы стварылі клеткі SW620, якія падвышана экспрэсуюць PACT, DARS-AS1 або абодва.Залішняя экспрэсія PACT паказала значнае інгібіраванне праліферацыі клетак (малюнак 3i).У той час як залішняя экспрэсія DARS-AS1 сама па сабе значна спрыяла праліферацыі клетак, істотнай розніцы ў хуткасці росту клетак з залішняй экспрэсіяй DARS-AS1 і PACT не было.Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што PACT можа супрацьстаяць павялічанай праліферацыі, выкліканай празмернай экспрэсіяй DARS-AS1.
Так як розныя рэгіёны DARS-AS1 маюць розныя PACT-звязваюць здольнасці, мы даследавалі іх адносны ўплыў на праліферацыі клетак рознай гиперэкспрессии фрагментаў DARS-AS1.У параўнанні з астатнімі двума фрагментамі, DARS-AS1 была сверхэкспрессирована на 3'-канцы (384-768 нт), асноўнай вобласці, звязанай з PACT, у DARS-AS1, якая мела найбольшую здольнасць стымуляваць праліферацыі клетак (мал. 3j).Гэтыя вынікі паказваюць станоўчую карэляцыю паміж здольнасцю звязвання і біялагічнай функцыяй DARS-AS1.
Паведамляецца, што PACT з'яўляецца праапоптозным бялком19.Такім чынам, мы даследавалі ўплыў DARS-AS1 на апоптоз.Як і чакалася, накдаўн DARS-AS1 значна павялічыў расшчапленне PARP у клетках SW620 і павялічыў долю анексін V-станоўчых клетак у клеткавых лініях SW620, HCT116, HepG2 і MBA-MD-231 (мал. 3k).3).3f-h), што паказвае на тое, што антиапоптозный эфект DARS-AS1 ў ракавых клетках процілеглы апоптоз-індукуе функцыі PACT.У сукупнасці гэтыя вынікі дазваляюць выказаць здагадку, што механізм анкагеннай функцыі DARS-AS1 можа быць праз інгібіраванне функцыі PACT.
Далей мы даследавалі функцыянальныя наступствы асацыяцыі DARS-AS1-PACT.Паведамляецца, што PACT актывуе PKR праз прамое ўзаемадзеянне, якое пасля ўзмацняе фасфараляванне eIF2α, выклікаючы дэлецыю трансляцыі і апоптоз17.Спачатку мы вывучылі, ці ўплывае DARS-AS1 на клеткавую лакалізацыю PACT і PKR.Канфакальная флуарэсцэнтная мікраскапія паказала, што PACT і PKR былі моцна лакалізаваны ў клетках SW620 з сярэднім каэфіцыентам карэляцыі Пірсана 0,72.Між тым, празмерная экспрэсія DARS-AS1 значна знізіла сумесную лакалізацыю PACT і PKR (сярэдні каэфіцыент карэляцыі Пірсана 0,61) (малюнак 4а).Каб высветліць, ці можа DARS-AS1 мадуляваць ўзаемадзеянне PACT-PKR, мы правялі аналіз сумеснай імунапрэцыпітацыі (co-IP) з антыцеламі супраць PACT у лізатах клетак SW620.PKR быў моцна ўзбагачаны анты-PACT ў кантрольных клетках, у той час як аднаўленне PKR было значна зніжана ў лізатах з клетак, якія падвышана экспрэсуюць DARS-AS1 (мал. 4b).Вычышчаныя пазначаныя PACT і PKR выкарыстоўваліся для аналізаў звязвання бялку in vitro.Адпаведна, тыя, якія забяспечвалі DARS-AS1, але не мелі кантрольнай РНК, паказалі падаўленне ўзаемадзеяння PACT-PKR (малюнак 4c).Усе вынікі паказалі, што DARS-AS1 парушыў сувязь PACT і PKR.
Сумесная лакалізацыя PACT і PKR ў кантрольных клетках або клетках, у якіх звышэкспрэсія DARS-AS1 назіралася з дапамогай канфакальнай флуарэсцэнтнай мікраскапіі.Ядра афарбоўвалі DAPI.Статыстычныя вынікі атрыманы па 16 фотаздымках.b Ка-імунапрэцыпітацыя (ка-ІП) з выкарыстаннем антыцелаў супраць PACT у клеткавых лізатах кантрольных клетак SW620 або клетак з падвышанай экспрэсіяй DARS-AS1.c Пазначаны PACT, вычышчаны PKR і транскрыбаваны in vitro з дапамогай DARS-AS1 або імітацыі РНК інкубавалі для аналізу звязвання бялку in vitro.Для иммунопреципитации выкарыстоўвалі антыцелы супраць сцяга.d Імунаблоты з указанымі антыцеламі праводзілі ў клетках SW620 і HCT116, трансфікаваных кантрольнай shRNA або DARS-AS1-shRNA з наступным галаданнем у сыроватцы крыві.Узровень экспрэсіі DARS-AS1 змяніў адчувальнасць клетак да тапсігаргіну.Клеткі SW620 трансфікавалі шРНК DARS-AS1, плазмідай гіперэкспрэсіі DARS-AS1 або кантрольнай плазмідай.Клеткі апрацоўвалі тапсигаргином на працягу 48 гадзін і вызначалі жыццяздольнасць клетак з дапамогай рэагента MTS.f Транскрыбаваныя in vitro DARS-AS1 або фіктыўная РНК і вычышчаны PACT выкарыстоўваліся для аналізу актывацыі in vitro і выяўлення імунаблотаў.g Імунаблоты з выкарыстаннем гэтых антыцелаў праводзілі на клетках SW620-ctrl (злева) або на клетках, якія экспрэсуюць мутанты PKR (справа).Затым гэтыя клеткі трансфецыравалі кантрольнай shRNA або DARS-AS1-shRNA з наступным сыроватачным галаданнем.ч. Праточная цытаметрыя паказала, што інактывацыя мутантнага PKR кампенсавала індукаваны DARS-AS1 апоптоз у клетках SW620.i Immunoblots з указанымі антыцеламі былі выкананы ў SW620 (злева) або HCT116 (справа) клетках.Клеткі, трансфікаваныя кантрольнай shRNA або DARS-AS1 shRNA, пазбаўлены сыроваткі і дапоўнены 100 нМ інгібітарам PKR C16 або DMSO.Шкала = 5 мкм.Паказаныя даныя з'яўляюцца сярэднім ± стандартным адхіленнем трох эксперыментаў.* p ≤ 0,05 двухбаковы t-крытэр Ст'юдэнта.
Звычайна лічыцца, што пасля ўзаемадзеяння PACT з PKR17 можа быць індукавана фасфараляванне PKR на Thr451.Нашы вынікі паказалі, што ўзровень фасфаралявання PKR быў значна павышаны ў накдаўн-клетках DARS-AS1 пасля сыроватачна галадання (мал. 4d і дадатковы малюнак 4a).Адпаведна, мы выявілі, што фасфараляванне eIF2α, асноўнага субстрата PKR, таксама было значна павялічана shRNA DARS-AS1 (мал. 4d і дадатковы малюнак 4a).Тапсігаргін з'яўляецца стрэсавым фактарам хуткай дапамогі, які прымушае экстраную дапамогу вызваляць Ca2+.Паведамляецца, што лячэнне тапсігаргінам індукуе экспрэсію і актывацыю PACT, які ў далейшым узаемадзейнічае і актывуе PKR, што прыводзіць да апоптозу за кошт павелічэння фасфаралявання eIF2α 18,61.Тут мы выкарыстоўвалі тапсігаргін як стымулятар шляху PACT/PKR, каб даследаваць, ці можа DARS-AS1 дапамагчы клеткам пераадолець стрэс, інгібіруючы шлях PACT/PKR.Мы заўважылі, што ўзровень экспрэсіі DARS-AS1 станоўча карэлюе з устойлівасцю клетак да тапсігаргіну.Клеткі SW620 з гиперэкспрессией DARS-AS1 выжывалі лепш пры апрацоўцы тапсигаргином, у той час як клеткі з накдаўнам DARS-AS1 сталі больш успрымальнымі (мал. 4e).У адпаведнасці з гэтымі вынікамі, празмерная экспрэсія DARS-AS1 зніжае фасфараляванне PKR, выкліканае тапсігаргінам (дадатковы мал. 4b).Наадварот, пасля лячэння тапсігаргінам PKR і eIF2α фасфараляваліся ў большай ступені ў накдаўн-клетках DARS-AS1 у параўнанні з кантрольнымі клеткамі (дадатковы мал. 4b).Цікава, што тапсігаргін індукаваў экспрэсію DARS-AS1 у залежнасці ад дозы, што можа сведчыць аб антыстрэсавай функцыі DARS-AS1 (дадатковы мал. 4c).Акрамя таго, мы правялі аналізы актывацыі in vitro, каб пацвердзіць гэтыя назіранні.Коратка, PKR ачышчалі ад клеткавых лізатаў з выкарыстаннем антыцелаў супраць PKR, затым інкубавалі з рэкамбінантнымі PACT і DARS-AS1, транскрыбаванымі in vitro.Пасля ферментатыўнай рэакцыі фосфа-PKR выяўлялі з дапамогай WB.Нашы вынікі паказалі, што фасфараляванне PKR істотна інгібіруецца DARS-AS1, але не кантрольнай РНК (мал. 4f).Гэтыя вынікі in vitro і in vivo сведчаць аб тым, што DARS-AS1 інгібіруе апасродкаваную PACT актывацыю PKR.У той жа час мы таксама назіралі зніжэнне аднаўлення PACT у прысутнасці DARS-AS1 (малюнак 4f).Гэты вынік супадае з вынікамі аналізу звязвання бялку in vitro (малюнак 4c) і яшчэ раз ілюструе функцыю блакіроўкі DARS-AS1 для асацыяцыі PACT-PKR.
Ser246 і Ser287 у дамене D3 PACT неабходныя для актывацыі PKR пры клеткавым стрэсе.Замена двух рэшткаў серыну на аланін дала мутантны PACT (mutD), які актываваў PKR пры адсутнасці стрэсу, а замена на аланін (mutA) змяніла пратакол.Паколькі мы прадэманстравалі важнасць гэтага дамена ў прамой сувязі з DARS-AS1, мы стварылі гэтыя два мутанта PACT, каб праверыць, ці могуць гэтыя рэшткі таксама ўдзельнічаць ва ўзаемадзеянні з DARS-AS1.Цікава, што абодва мутанты страцілі здольнасць звязвацца з DARS-AS1 (дадатковы малюнак 4d), што сведчыць аб тым, што поўная структура бялку PACT можа спатрэбіцца для эфектыўнага ўзаемадзеяння з DARS-AS1.
Акрамя таго, нашы вынікі таксама сведчаць аб тым, што інгібіраванне праліферацыі клетак, выкліканае DARS-AS1-shRNA, можа быць часткова адноўлена за кошт залішняй экспрэсіі дамінантна-адмоўнага мутанта PACT (PACTmutA) або дамінантна-адмоўнага мутанта PKR (PKRmut) (дадатковы малюнак 4e. e).Гіперэкспрэсія дамінантна-адмоўных мутантаў PKR зніжае фасфараляванне PKR, выкліканае накдаўнам DARS-AS1, а таксама фасфараляванне eIF2α ў клетках, пазбаўленых сыроваткі (мал. 4g).Што яшчэ больш важна, доля апоптотических клетак, выкліканых накдаўнам DARS-AS1, таксама была зніжана ў клетках, якія падвышана экспрэсуюць PKRmut (мал. 4h і дадатковы малюнак 4g).Інгібіраванне актыўнасці кіназы PKR таксама пагаршае функцыю DARS-AS1, паколькі вынікі паказалі, што накдаўн DARS-AS1 рэдка выклікае фасфараляванне PKR і eIF2α, калі клеткі апрацоўвалі PKR-спецыфічным інгібітарам C16 (мал. 4i і дадатковы малюнак 4h).).У сукупнасці нашы вынікі сведчаць аб тым, што DARS-AS1 спрыяе праліферацыі клетак, па меншай меры часткова, шляхам інгібіравання апасродкаванай PACT актывацыі PKR.
Для далейшага вывучэння ролі DARS-AS1 у пухлінагенезе мы правялі эксперыменты in vivo з выкарыстаннем мадэлі ксенотрансплантата мышы. Вынікі паказваюць, што накдаўн DARS-AS1 рэзка зніжае рост пухліны ў мышэй (значэнне р <0,0001) (мал. 5а). Вынікі паказваюць, што накдаўн DARS-AS1 рэзка зніжае рост пухліны ў мышэй (значэнне р <0,0001) (мал. 5а). Вынікі паказваюць, што нокдаун DARS-AS1 рэзка зніжае рост пухліны ў мышы (значэнне p <0,0001) (рыс. 5а). Вынікі паказваюць, што накдаўн DARS-AS1 рэзка зніжае рост пухліны ў мышэй (значэнне р <0,0001) (малюнак 5а).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）(图5a）). Вынікі паказалі, што нокдаун DARS-AS1 значна зніжае рост апухолі ў мышы (значэнне р <0,0001) (рыс. 5а). Вынікі паказалі, што накдаўн DARS-AS1 значна зніжае рост пухліны ў мышэй (значэнне р <0,0001) (малюнак 5а).Такім чынам, у накдаўн-групе DARS-AS1 было значнае зніжэнне сярэдняга аб'ёму пухліны прыкладна на 72,9% і сярэдняй масы пухліны прыкладна на 87,8% (малюнак 5b-d).Гэтыя вынікі пераканаўча сведчаць аб тым, што DARS-AS1 можа значна спрыяць росту пухліны in vivo.
Ўплыў аб'явы DARS-AS1 накдаўн на колоректального онкогенеза ў голых мышэй.Паказаны крывыя росту (а), памер пухліны (б), вага (с) і выявы пухліны (г).Палоскі памылак уяўляюць ±SEM. n = 10. ****p <0,0001, паводле двухбаковага t-крытэрыю Сцьюдэнта. n = 10. ****p <0,0001, паводле двухбаковага t-крытэрыю Сцьюдэнта. n = 10. ****p < 0,0001 па двухбаковым крытэрыю Сцюдэнта. n = 10. ****p <0,0001 двухбаковы t-крытэр Ст'юдэнта.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 па двухбаковым крытэрыю Сцюдэнта. ****p <0,0001 двухбаковы t-крытэр Ст'юдэнта.Каплан-Маер прааналізаваў карэляцыю паміж узроўнем экспрэсіі DARS-AS1 і агульнай выжывальнасцю ў пацыентаў з UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM і LGG.Высокія ўзроўні экспрэсіі DARS-AS1 у пацыентаў былі ў верхніх 50%;нізкі ўзровень экспрэсіі DARS-AS1 у пацыентаў быў у ніжніх 50%.p-значэнні былі вызначаны з дапамогай тэсту log rank.f Прапанаваная мадэль, у якой DARS-AS1 рэгулюе шлях PACT-PKR і рост пухліны.
Каб лепш зразумець клінічнае ўздзеянне DARS-AS1, мы вывучылі карэляцыю паміж яго экспрэсіяй і выжывальнасцю пацыентаў.Аналізуючы набор даных TCGA, мы выявілі, што больш высокая экспрэсія DARS-AS1 была звязана з меланомай увеі (UVM), нырачнай храмафобіяй (KICH), нырачна-папіллярные клеткавым ракам (KIRP), мезатэліёмай (MESO), мультыплексам.Больш нізкая выжывальнасць была ў значнай ступені звязана з морфозам глиобластомы (GBM) і пацыентамі з глиомой галаўнога мозгу нізкага ўзроўню (LGG) (малюнак 5e).Гэтыя вынікі дазваляюць выказаць здагадку, што DARS-AS1 можа гуляць важную ролю ў клінічным прагрэсаванні пухліны і можа быць патэнцыйным прагнастычным біямаркерам пры некалькіх відах раку.
У гэтым даследаванні з выкарыстаннем буйнамаштабнага функцыянальнага скрынінга CRISPRi мы вызначылі, што lncRNA DARS-AS1 пераадольвае стрэс ракавых клетак, рэгулюючы дзве ключавыя сістэмы, якія рэагуюць на стрэс, PACT і PKR.Узаемадзейнічаючы непасрэдна з PACT, DARS-AS1 інгібіраваў апасродкаваную PACT актывацыю PKR, тым самым прадухіляючы апоптозную гібель клетак і спрыяючы праліферацыі клетак (мал. 5f).Павышэнне рэгуляцыі DARS-AS1 назіралася пры розных тыпах раку, што сведчыць аб тым, што яго функцыя садзейнічання выжыванню ракавых клетак у стрэсавых умовах можа шырока прымяняцца да розных тыпаў раку.
PACT быў ідэнтыфікаваны як бялок-актыватар PKR, і апасродкаваная PACT актывацыя PKR гуляе важную ролю ў рэакцыях на стрэс, рэгулюючы транскрыпцыю, трансляцыю, апоптоз і іншыя важныя клеткавыя працэсы62.На працягу дзесяцігоддзяў рабіліся спробы зразумець спецыфічную для рака рэгуляцыю каскаду PACT-PKR.Тут наша даследаванне выявіла іншы механізм рэгуляцыі PACT-PKR ў ракавых клетках праз клеткавую lncRNA DARS-AS1, якая непасрэдна звязваецца з PACT, блакуе ўзаемадзеянне PACT-PKR, інгібіруе актывацыю PKR і фасфараляванне eIF2α, тым самым інгібіруючы апоптоз, выкліканы стрэсам і стымулюючы канчатковую праліферацыі рака.вочак.Гэта адкрыццё пралівае святло на патэнцыйныя мішэні lncRNA для прагназавання і тэрапіі рака.
Нашы дадзеныя паказалі, што накдаўн DARS-AS1 сенсібілізуе клеткі да сыроватачна галадання са значным павелічэннем фасфарыляванага PKR і eIF2α.Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што DARS-AS1 спрыяе выжыванню ракавых клетак у цяжкіх умовах шляхам інгібіравання актыўнасці PACT/PKR.Некалькі іншых некадуючых РНК, такіх як ASPACT і nc886, таксама ўдзельнічаюць у восі PACT/PKR, зніжаючы рэгуляцыю мРНК PACT48 або рэгулюючы аўтафасфараляванне шляхам звязвання з PKR49,50,64.Сярод іх DARS-AS1 выступае ў ролі разбуральніка асацыяцыі PACT-PKR.Гэта даследаванне ўзбагачае наша разуменне рэгуляцыі восі PACT/PKR і ролі lncRNA ў рэакцыях на стрэс.
PACT змяшчае тры асобныя дамены.Кожнага з першых двух dsRBD дастаткова для дасягнення высокай аффинности звязвання PACT з PKR, у той час як трэці дамен (D3) неабходны для актывацыі PKR in vitro і in vivo.Наша даследаванне паказала, што DARS-AS1 пераважна ўзаемадзейнічае з даменам D3 (мал. 3h).Улічваючы вялікі памер lncRNA (768 нуклеатыдаў), звязванне DARS-AS1 з D3 можа фізічна інгібіраваць узаемадзеянне паміж даменам PACT dsRBD і PKR, тым самым блакуючы асацыяцыю PACT і PKR.Кропкавыя мутацыі PACT, якія замянілі Ser246 і Ser287 у D3 на аланін або аспартат, парушаюць яго сродства да звязвання з DARS-AS1, паказваючы на ​​важнасць агульных структурных і электрычных уласцівасцей D3 у іх сувязі.Дадатковая інфармацыя аб гэтым механізме спатрэбіцца ў будучыні з выкарыстаннем больш дакладнага біяхімічнага аналізу і структурнага аналізу PACT з высокім дазволам.
Папярэднія даследаванні паказалі, што DARS-AS1 спрыяе праліферацыі клетак з дапамогай некалькіх механізмаў51,52,53.У адным прыкладзе даследчыкі заўважылі, што DARS-AS1 павышае рэгуляцыю свайго гена DARS, які кадуе антысэнсавы бялок, нацэльваючы miP-194-5p на клеткі рака ныркі.Аднак у дадзеным даследаванні накдаўн DARS-AS1 практычна не паўплываў на транскрыпцыю DARS пры розных відах раку, у тым ліку прынамсі колоректального рака, рака малочнай залозы і печані.Паколькі lncRNA дэманструюць спецыфічныя для клетак і тканак патэрны экспрэсіі, функцыянальныя механізмы могуць не захоўвацца ў розных тыпах раку, што можа спрыяць разыходжанню паміж нашымі назіраннямі і папярэднімі ацэнкамі розных відаў раку.Для высвятлення спецыфічных механізмаў розных фізіялагічных і паталагічных працэсаў неабходныя спецыяльныя даследаванні.
Аналіз клінічных дадзеных паказаў, што экспрэсія DARS-AS1 у пухлінах знаходзіцца ў зваротнай карэляцыі з выжывальнасцю хворых на рак, што падкрэслівае важнасць восі DARS-AS1/PACT/PKR у прагнозе рака.У заключэнне наша даследаванне паказвае, што DARS-AS1 з'яўляецца рэгулятарам сігнальнай восі PACT/PKR, спрыяе праліферацыі ракавых клетак і інгібіруе апоптоз падчас рэакцыі на стрэс, што забяспечвае яшчэ адзін напрамак даследаванняў і ўяўляе цікавасць для будучых даследаванняў патэнцыйных метадаў лячэння .
Клеткавыя лініі чалавека SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 і HEK293T былі атрыманы з Нацыянальнай інфраструктуры рэсурсаў клетачных ліній у Кітаі.Усе клеткі вытрымлівалі ў асяроддзі DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) з дадаткам 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) і 1% пеніцылін-стрэптаміцын (Thermo Fisher Scientific) пры 37°C, 5% CO2.інкубатар.
Анты-ПАКТ, Abcam (ab31967);Анты-PKR, Abcam (ab184257);Анты-PKR (фосфо-T451), Abcam (ab81303);Анты-сцяг, Abcam (ab125243);Анты-eIF2α, Abcam (A0764));анты-eIF2α (фосфар S51), Abcam (ab32157);анты-PACT (фосфар S246), Abgent (AP7744b);анты-β-тубулін, CST (2128);нармальны IgG мышы, CST (5415S);нармальны IgG труса, CST (2729S).Антыцелы разводзілі 1:1000 у PBST для Вестэрн-блоттинга і 1:100 для IP.
sgRNA былі распрацаваны з дапамогай агульнадаступнага інструмента пад назвай CRISPR-ERA66.Мы выкарыстоўвалі параметры інструмента па змаўчанні для распрацоўкі sgRNA, а алгарытм вылічыў сайты звязвання sgRNA у вобласці памерам 3 кб.з цэнтрам у ТСС.Пулы алігануклеатыдаў sgRNA былі сінтэзаваны ў CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) і кланаваны ў гуманізаваныя плазміды pgRNA (Addgene #44248).У агульнай складанасці 12 мкг аб'яднанай гуманізаванай плазміды pgRNA, 7,2 мкг psPAX2 (Addgene #12260) і 4,8 мкг pMD2.G (Addgene #12259) былі сумесна трансфікаваны ў 5 х 106 HEK293T у 10 см чашках з выкарыстаннем трансфекцыйнага рэагента DNAfect ячэйкі (CWBIO, Пекін, Кітай), вынікаючы інструкцыям вытворцы.Супернатанты, якія змяшчаюць вірус, збіралі праз 48 і 72 гадзіны пасля трансфекцыі і фільтравалі праз фільтр 0,45 мкм.Для скрынінга шляхам трансдукцыі віруса былі атрыманы клеткі SW620, якія экспрэсуюць зліты бялок dCas9/KRAB.Мадыфікаваныя клеткі SW620 заражалі бібліятэкай вірусаў у чатырох незалежных эксперыментах па заражэнні пры MOI 0,1-0,3 і ўзялі пробы з 2 мкг/мл пураміцыну (Sigma, St. Louis, MO) на працягу 2 дзён.Пасля гэтага клеткі культывавалі на працягу 18 дзён in vitro з мінімальным ахопам бібліятэкі 500 клетак/sgRNA для скрынінга.
Геномную ДНК вылучылі ў адпаведнасці з інструкцыямі QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Дзюсельдорф, Германія; 51183).У агульнай складанасці для стварэння бібліятэкі было выкарыстана 100 мкг геномнай ДНК на адзін біялагічны паўтор.Вобласць sgRNA была ампліфікавана двума раундамі ПЦР і звязана са штрых-кодам.
Прадукты ПЦР ачышчалі з дапамогай геля NucleoSpin® і набору для ачысткі ПЦР (MACHEREY-NAGEL, Düren, Германія; 740609.250) і колькасна вызначалі з дапамогай набору для выяўлення двухланцуговай ДНК Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Аналіз MTS быў выкарыстаны для вымярэння праліферацыі клетак.Клеткі высейвалі ў 96-лункавыя пласціны пры пачатковай шчыльнасці 2000 клетак/лунку.Адносная колькасць клетак вымяралася штодня ў паказаны час на працягу 4-6 дзён.Для кожнай лункі 20 мкл рэагента MTS (Promega) разводзяць 100 мкл DMEM, инкубируют з клеткамі на працягу 4 гадзін пры 37 ° C, а затым вымяраюць OD490.
Здольнасць да незамацаванага росту была выяўлена пры аналізе фарміравання сфер.Коратка, 2000 клетак, трансфікаваных shRNA DARS-AS1 або кантрольнай shRNA, культывавалі ў мікрапласцінах са звышнізкім прымацаваннем (Corning) са зменай асяроддзя кожныя 4 дні.Сфероіды былі падлічаны праз 14 дзён.500 клетак, трансфікаваных плазмідай гіперэкспрэсіі DARS-AS1 або кантрольнай плазмідай, выкарыстоўвалі для аналізу ўзмацнення, у астатнім метад не змяніўся.
РНК транскрыбавалі з выкарыстаннем Т7 РНК-палімеразы і біятын-16-UTP (Roche 1138908910) у адпаведнасці з інструкцыямі Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Праймеры, якія выкарыстоўваюцца тут, пералічаны ў дадатковай табліцы 4.
Рагі PACT або PKR, якія кадуюць бялок, кланавалі ў pET15b (Addgene #73619) і трансфармавалі ў BL21(DE3).Бактэрыі інкубавалі на працягу ночы ў LB з ампіцылінам, а затым развялі ў 100 разоў свежым LB.Калі OD600 асяроддзя дасягнула 0,8, дадалі 1 мМ IPTG, каб выклікаць экспрэсію бялку.Пасля інкубацыі на працягу ночы з асцярожным устрэсваннем (250 абаротаў у хвіліну пры 20 ° C) клеткавы асадак збіралі цэнтрыфугаваннем (4000 абаротаў у хвіліну, 10 хвілін, 4 ° C).Рэсуспендуйце клетачны асадак у буферы для лізісу (50 мм Tris, pH 8,0, 250 мм NaCl, 1 мМ PMSF) і інкубуйце на лёдзе на працягу 30 хвілін, затым апрацуйце ультрагукам (15 хвілін, 5 секунд уключэння/выключэння, на лёдзе) і цэнтрыфугу (13000 абаротаў у хвіліну)., 30 мін, 4°С).Затым супернатант загружалі на смалу Ni-NTA (QIAGEN) 3 разы пры 4°C, прамывалі 4 разы буферам для прамывання (50 мм Tris, рн 8,0, 40 мм імідазолу, 250 мм NaCl) і элюіравалі 3 разы, з агульнай колькасцю 10 мл буфера для элюента (50 мм Tris, рн 8,0, 250 мм NaCl, 300 мм імідазолу).Вычышчаны бялок вызначалі з дапамогай WB, а канцэнтрацыю вызначалі з дапамогай набору для аналізу бялку Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Аналізы RIP праводзіліся, як апісана раней, з мадыфікацыямі.Карацей кажучы, 1x RIP буфер (25 мм Tris-HCl, pH 7,5, 100 мм NaCl, 0,5% NP-40, інгібітар рыбануклеазы РНК (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 мм DDM, пратэаза) лізуе цытастатычны кактэйль 1 x 107 (Roche, 1 мМ DTT) і цэнтрыфугуйце пры 13000 абаротаў у хвіліну на працягу 15 хвілін пры 4 °C.Затым супернатант інкубавалі з магнітнымі шарыкамі бялку A+G (Millipore), кан'югаванымі з 5 мкг антыцелаў супраць PACT (Abeam) або IgG (CST).Шарыкі прамывалі 5 разоў 5-кратным буферам RIP, затым расшчаплялі протеиназой K (NEB).РНК экстрагировали тризолом і вызначалі RT-qPCR.Праймеры прадстаўлены ў дадатковай табліцы 5.
Тэст in vitro RIP праводзіўся ў адпаведнасці з мадыфікаваным стандартным пратаколам аналізу RIP.У агульнай складанасці 5 пмоль транскрыбаванай in vitro РНК разбаўлялі 1x буферам RIP і адпальвалі шляхам інкубацыі пры 65°C на працягу 5 хвілін з наступным павольным астуджэннем да пакаёвай тэмпературы.У агульнай складанасці 5 пмоль інтактных або мутаваных бялкоў PACT, пазначаных сцягам, былі ачышчаны ад кішачнай палачкі.Інкубуйце з рэнатураванай РНК на працягу 2 гадзін пры 4°C і выконвайце апісаную вышэй працэдуру для RIP-аналізу на антыфлаг IP.
Для аналізу пашырэння РНК 1×107 клетак лізіравалі буферам 1xRIP.Пасля цэнтрыфугавання пры 13000 абаротаў у хвіліну на працягу 15 хвілін пры 4 ° С, супернатант папярэдне апрацоўвалі 30 мкл стрэптавідыну магнітных шарыкаў (Бекмана) на працягу 2 гадзін пры 4 ° С.Затым у вычышчаны лізат дадаюць дражджавую тРНК і інкубуюць з 40 пмоль рэнатураванай РНК на працягу ночы пры 4°C, затым яшчэ 2 гадзіны і дадаюць 20 мкл новых магнітных шарыкаў стрэптавідыну, заблакаваных BSA.Этап прамывання складаўся з 4 разоў з 5-кратным буферам RIP і 4 разоў з 1-кратным буферам RIP.Адпаведныя вавёркі элюировали буферам для элюцыі біятыну (25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 мм D-біятын, PMSF) і падзялялі на NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Пасля афарбоўвання срэбрам (Beyotime Biotechnology) пэўныя палосы былі выразаны і прааналізаваны MS.
Co-IP аналіз быў праведзены для праверкі ўзаемадзеяння паміж PACT і PKR.Карацей кажучы, надосадочную вадкасць лізатаў рыхтавалі шляхам інкубацыі 1 х 107 лізаваных клетак у 1 х RIP-буферы з наступным цэнтрыфугаваннем пры 13000 абаротаў у хвіліну на працягу 15 хвілін пры 4°C.У лізаты загружалі магнітныя шарыкі бялку A + G, кан'югаваныя з 5 мкг антыцелаў супраць PACT і асцярожна паварочвалі на працягу ночы пры 4°C.Шарыкі прамывалі 3 разы буферам 5 × RIP, двойчы буферам 1 × RIP і элюіравалі буферам 1 × SDS.Атрыманы бялок быў прааналізаваны з дапамогай SDS-PAGE геля і выяўлены WB.
Два пмоль пазначанага PACT і 1 пмоль PKR былі ачышчаны ад кішачнай палачкі.Развядзіце ў 1 × RIP-буферы і інкубуйце з 10 пмоль рэнатураванай РНК на працягу 2 гадзін пры 4 °C.Пасля гэтага іх інкубавалі з кан'югаванымі з магнітнымі шарыкамі бялку A+G антыцеламі супраць пазнакі яшчэ дзве гадзіны.Затым шарыкі чатыры разы прамывалі буферам 1x RIP і элюіравалі буферам 1x SDS.Атрыманыя PACT і PKR былі выяўлены WB.